[发明专利]基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法。本发明从光合作用能流角度出发，采用叶绿素荧光作为光合作用的探针，提出一种浮游植物叶绿素荧光的可变光脉冲诱导方法，将复杂的光合作用能流过程分段，通过分析不同诱导模式下叶绿素荧光动力学曲线，分段获得主导光合作用能流效率的光合参数；在此基础上，根据生物膜能流过程，建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测，为发展现场原位测量技术提供方法基础。

主权项

基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计快速可变光脉冲激发策略，实现光合作用能流过程的分段浮游植物细胞经暗适应后，参与Calvin循环的几种酶失去活性，重新照光后需要经过一个光合诱导期才能正常运行；在光合诱导期内，所有的电子受体均能接收电子被还原，却不能及时给出电子被氧化，存在一个单电子周转期，不同电子受体单周转的周期不同；在单周转期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减少至零，电子传递链被阻塞，叶绿素荧光快速上升至最大；单周转期后，电子受体再氧化给出电子，叶绿素荧光开始弛豫下降；QA、QB和PQ单周转周期分别为100μs、1ms和10‑20ms，是电子传递链中的容易产生电子阻塞的三个电子受体，采用快速可变的光脉冲作激发光源，通过调节光脉冲振幅、频率、占空比和激发时序，设计不同的激发策略，选择性还原QA、QB和PQ，获取不同诱导模式下的叶绿素荧光动力学曲线；①QA饱和快相荧光动力学曲线在不造成光损伤的情况下，采用占空比大的高强度快速光脉冲，在QA单电子周转内产生足够高的能量累积，将其全部还原，打断光合作用的电子传递链，获得QA饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与QA之前光合能流过程有关；②QB饱和快相荧光动力学曲线QA单周转期后，电子向后传递给QB；通过降低脉冲光瞬时光强和占空比，在QB单周转期内使QA发生更多氧化还原反应，将电子传递到QB，将其全部还原，阻塞电子传递链，获得QB饱和快相荧光动力学曲线，该曲线仅与QB之前光合能流过程有关；③PQ饱和快相荧光动力学曲线再次降低脉冲光瞬时光强和占空比，在PQ单周转期内使QB发生更多氧化还原反应，将电子传递到PQ，将其全部还原，阻塞光电子传递链，产生PQ饱和快相荧光动力学曲线，该曲线取决于PQ之前光合能流过程；④PQ饱和弛豫荧光动力学曲线PQ电子饱和后，关闭饱和光脉冲，使用微弱探测光脉冲激发，为了减小探测光对光合作用过程影响，探测光脉冲需要保持较低光强和占空比；PQ饱和模式下，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ重新被氧化，电子向后传递，探测光脉冲诱导荧光出现弛豫下降过程，该过程仅与PQ后光合能流过程有关；(2)分析叶绿素荧光动力学曲线，获取主导光合作用能流效率的光合参数在浮游植物光合诱导期内，强光照射促使能够接收电子的电子受体数快速减少至零，叶绿素a分子吸收的激发能就不再参与光化学反应，表现为叶绿素荧光的快速上升；过了光合诱导期后，Calvin循环得以正常运行，叶绿素荧光开始弛豫下降；根据浮游植物光合作用能量传递模型，该叶绿素荧光动力学过程f(t)表示为激发光能I(t)、功能吸收截面σPSII、光化学反应电荷分离效率η和电子受体再氧化动力学过程的函数；f(t)=F0+(Fm-F0)C(t)η1-C(t)(1-η)---(1)]]>F0为所有PSII反应中心都打开时的初始荧光，Fm为PSII反应中心全部关闭时的最大荧光，C(t)是t时刻PSII反应中心关闭比例或关闭状态，C(t)取决于激发光能I(t)至PSII的传递速率和QA的再氧化速率，由下式表示：C(t)=σPSII∫0tI(v)1-C(v)1-C(v)(1-η)g(t-v)dv---(2)]]>函数g(t)描述了t时刻QA的再氧化动力学过程，取决于其后的电子传递速率由下式表示：然而，由于公式(1)‑(3)非线性很强，不存在能够描述叶绿素荧光信号与激发信号之间函数关系的解析解，采用快速光脉冲和高速采样率测量叶绿素荧光动力学曲线，公式(1)‑(3)可离散化为公式(4)‑(6)的递归形式：fn=F0+(Fm-F0)Cnη1-Cn(1-η)---(4)]]>fn为第n个光脉冲的叶绿素荧光采样值，Cn为第n个脉冲时PSII反应中心关闭状态，表示如下：Cn=Cn-1Σk=14An,k+InσPSII1-Cn-1Σk=14An,k1-(1-η)Cn-1Σk=14An,k---(5)]]>In为第n个光脉冲的激发能量，An,k取决于QA及其后的电子受体的再氧化动力学过程：αk和分别是各电子受体的再氧化幅值常数和电子传递速率，Δt是光脉冲周期；理论上通过(4)‑(6)式对fn进行拟合，便反演得到之前列举的所有的荧光参数；然而，(4)‑(6)式中共有包括功能吸收截面、电子传递速率在内的7个光合参数，直接进行荧光动力学曲线拟合仍无法得到准确的数值解；因此，通过分析QA、QB和PQ饱和模式下的快相荧光和弛豫荧光，分段研究光合作用过程，以减少拟合参数个数，使拟合函数对某个或几个参数更加敏感，获得准确有效的光合参数；①QA饱和快相荧光分析QA饱和模式下，电荷在QA处累积，电子传递链中断，荧光快速上升，得到PSII反应中心全部关闭时的最大荧光Fm、所有PSII反应中心都打开时的初始荧光F0；该快相荧光过程与QA后的电子传递过程无关，(4)‑(6)式得以简化：fn=F0+(Fm-F0)Cnη1-Cn(1-η)---(7)]]>Cn=Cn-1+InσPSII1-Cn-11-(1-η)Cn-1---(8)]]>通过(7)、(8)式对QA饱和模式的快相荧光进行曲线拟合，得到功能吸收截面σPSII和电荷分离效率η，同时,计算出最大光量子效率Δφ＝(Fm‑Fo)/Fm；②QB饱和快相荧光分析QB饱和模式下，电荷在QB处累积，该快相荧光过程与QB后的电子传递过程无关，F0、Fm、σPSII和η保持不变且已知，通过(4)‑(6)式分析QB饱和下的快相荧光曲线能够准确得到QA到QB间电子传递速率③PQ饱和快相荧光分析PQ饱和模式下，电荷在PQ处累积，该快相荧光过程与PQ后的电子传递过程无关，同理通过QB饱和下的快相荧光分析能准确得到QB到PQ间电子传递速率④PQ饱和弛豫荧光分析PQ电子饱和后，PQ池被全部还原，探测光脉冲产生的荧光达到峰值，PQ单周转期结束，PQ再氧化过程开启，在PQ处累积的电荷向后传递，光合作用正向电子传递效率非常高，逆向电子传递过程能忽略，荧光呈现弛豫下降过程，该过程仅与PQ后光合能流过程有关，通过(5)式，即能拟合出PQ至PSI电子传递速率和PSI至Fd的电子传递速率(3)结合生物膜能流理论，建立浮游植物光合速率叶绿素荧光分析方法浮游植物光合速率是活体细胞对光能吸收、转化和利用效率，即参与光化学反应能量占激发光能量的比例；根据生物膜能流理论，浮游植物光合速率ψ与最大光量子效率，功能吸收截面σPSII，电荷分离效率η，以及QA、QB、PQ、PSI和Fd主要电子受体间的电子传递速率这些光合参数线性相关，具体由(9)式计算：通过(9)式建立基于叶绿素荧光的浮游植物光合速率的定量分析方法，实现浮游植物光合作用状态和生长潜能的实时快速检测。