[发明专利]一种获得斗鸡特异性分子标记的方法有效

专利信息
申请号: 201410468007.6 申请日: 2014-09-15
公开(公告)号: CN104313129A 公开(公告)日: 2015-01-28
发明(设计)人: 常国斌;王洪志;廖和荣;马腾;徐琪;徐璐;张扬;万方;李志腾;郭晓敏;孙杰;陈国宏 申请(专利权)人: 扬州大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
代理公司: 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 代理人: 柏尚春
地址: 225009 *** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 发明公开了一种获得斗鸡特异性分子标记的方法,通过目标区域捕获测序筛查不同鸡种的16号染色体,利用MEGA软件进行序列比对,根据比对结果利用Oligo等软件设计引物,对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证。根据测序结果发现,斗鸡与其他鸡种在一段序列上存在特异性差异,差异在于这段序列上固始鸡存在特异性的18个bp的缺失(CATTCCCGTTCCCGTTCG),其他鸡种无此特点,通过琼脂糖凝胶电泳也可清晰的鉴别出来。因此,这段序列可以作为一种鉴定斗鸡特异性的分子标记。应用这种分子标记鉴定鸡种,操作相对简单,特异性高而且重复性高,也为家禽品种资源的正确保存和合理利用增添了新的科学依据。
搜索关键词: 一种 获得 斗鸡 特异性 分子 标记 方法
【主权项】:
一种获得斗鸡特异性分子标记的方法,其特征在于:通过目标区域捕获测序筛查27种鸡种的16号染色体,并利用MEGA软件进行序列比对,根据比对结果利用Oligo软件设计引物,对不同鸡种进行PCR扩增并进行测序验证,根据分析结果即可得到斗鸡特异性的分子标记,即CATTCCCGTTCCCGTTCG,具体步骤如下:材料与方法1.1实验材料选取罗斯鸡、黑狼山鸡、斗鸡、如草鸡、固始鸡、藏鸡、乌骨鸡、雪山草鸡、红色原鸡、萧山鸡、隐性白羽肉鸡、茶花鸡、鹿苑鸡、安卡鸡、油鸡、大骨鸡、文昌鸡、青脚麻鸡、太湖鸡、溧阳鸡、绿壳蛋鸡、AA鸡、广西黄鸡、来航鸡、仙居鸡、白耳鸡、广西黄鸡27种不同鸡种;1.2目标区域捕获测序对每个鸡品种采集10个样本,翅静脉采血0.4ml,加入0.5mol/LNa2EDTA抗凝剂2μL,加入裂解液4ml后于4℃保存备用;利用苯酚抽提法提取DNA,送入华大基因公司进行目标捕获测序,选取Gallus_gallus‑4.0作为参考基因组;1.3序列比对目标区域捕获测序得到不同鸡种在16号染色体上的全序列,利用软件MEGA5.1对不同鸡种间进行序列比对,发现不同鸡种在序列上的差异情况;1.4引物设计根据序列比对结果,选取不同鸡种间出现特异性差异的一段序列,利用不同鸡种DNA作为模板,并利用Oligo软件设计引物进行PCR扩增,引物名称为:DOUJI;座位:chromosome16;5′‑3′的引物序列为:F:CCGCGCTGACCTCGTCTCGCTGTGT,R:CTCGGCGGGGCAGCAGCTAATTCAG;退火温度:66.3℃;1.5PCR扩增和检测PCR扩增总体积为20μL:1μLDNA模板,其浓度为100ng/μL,2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTP,浓度为10mmol/L,上下游引物各1μL,浓度为10pmol/μL,Taq酶为0.2μL,浓度为5U/μL,ddH2O13.3μL;PCR扩增程序:95℃预变性5min,94℃变性40s,适宜退火温度40s,72℃延伸40s,35个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存备用;把PCR产物进行测序并用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测,电压为100V,电泳40min;结果通过目标区域捕获测序,发现了斗鸡与其他鸡种存在差异的一段序列,设计引物PCR扩增进行重测序并用琼脂糖凝胶电泳进行验证,发现斗鸡与其他鸡种在这段序列上存在特异性差异,差异在于:在这段序列上斗鸡存在特异性的18个bp的缺失,即CATTCCCGTTCCCGTTCG。
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