[发明专利]一种水稻的miRNA及其前体基因和它们在对镉敏感转基因水稻的育种上应用

摘要

本发明涉及水稻基因生物领域，尤其涉及一种水稻的miRNA及其前体基因和它们在对镉敏感转基因水稻的育种上应用。一种水稻的miRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过将水稻miR268转化到水稻愈伤组织，将获得的T2代种子播种在含镉培养基中，发现过表达miR268的水稻植株对镉敏感。本发明进而通过包含所述水稻miRNA的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的水稻转基因株系。通过转基因手段发现该miRNA具有显著增加水稻对镉敏感性的作用。

主权项

一种具有对镉敏感转基因水稻的育种方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）提取野生型水稻中花11七天龄幼苗DNA：取约0.2 g水稻叶片用液氮研磨成粉末，转移粉末到加有500 μl提取液的离心管中，提取液包括100 mM Tris‑HCl，pH 8.0；20 mM EDTA；500 mM NaCl，轻轻混匀；向管中加入100 μl 10% SDS溶液，混匀，65℃保温20 min；然后加氯仿/异戊醇/乙醇混合液600 μl，氯仿/异戊醇/乙醇体积比为20:1:4，室温静止10 min；4℃，12000 rpm离心10 min，转移上清至另一离心管中；加入1ml预冷的无水乙醇充分混匀，‑20℃沉淀DNA 20 min；4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清，加70%乙醇500 μl进行洗涤；4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清；轻微离心，用移液器将残留液体吸干；吹干DNA沉淀后，溶于100 μl 含RNase酶TE中，RNase酶的浓度为10 μg/ ml ，37 ℃水浴30 min，‑20℃保存；根据miR268前体序列，在database中查阅其所在基因组位点的两端的序列，分别在前体发夹结构两端约50 bp处设计引物，所设引物如下：miR268‑F，5’‑ CGGGGTACCTAACAGGAGAGCTGGACC ‑3’miR268‑R，5'‑ AACTGCAGCATCCGAGTGACAATCAG ‑3'；2）接着以DNA为摸板，利用所设引物扩增miR268前体基因，前体基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示：PCR反应体系为50 μl，依次加入DNA模板1 μl、10× PCR buffer 5 μl、10 mM dNTPs 4 μl、10 μM正向引物miR268‑F 0.8 μl、10 μM反向引物miR268‑R 0.8 μl、5 U/μl 的TaKaRa Taq聚合酶0.5 μl，最后加ddH2O补至50 μl；PCR反应条件：预变性94℃ 5 min，变性94℃ 30s，退火59℃ 30s，延伸72℃ 30s，30个循环，最后延伸72℃ 10 min，4℃保存；3）扩增后将miR268前体基因DNA产物，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，操作如下：将DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入1.5 ml的Eppendorf管中，称取重量；加入6倍体积溶胶液PN，50℃水浴放置30 min；将溶胶液加入吸附柱CA2中，室温放置2 min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；加入600 μl漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液；12000rpm离心2min，室温放置数分钟彻底晾干；将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，加入40 μl洗脱缓冲液EB，12000rpm离心2 min收集DNA溶液；4）将回收的miR268前体基因DNA与pMD19‑T载体TakaRa进行连接反应：连接体系10 μl，分别加入0.5 μl pMD19‑T载体、4.5 μl纯化的miR268前体的DNA、5 μl Solution I；16℃下连接3 h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19‑ miR268；5）将提取的质粒pMD19‑miR268和DNA双元质粒载体pCAMBIA1301同时都用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切：酶切体系50 μl，包括5 μl 10×M buffer、28 μl pMD19‑miR268质粒或pCAMBIA1301质粒、1 μl KpnI、1 μl PstI和15 μl ddH2O，37℃水浴过夜；将DNA双元质粒载体pCAMBIA1301和克隆质粒pMD19‑miR268酶切后，割胶回收DNA片段；接着用T4连接酶连接，连接体系10 μl，包括1 μl pCAMBIA1301载体、7.5 μl miR268 DNA、1 μl 10×T4连接酶buffer和0.5 μl T4连接酶，16℃连接过夜；然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定，将正确的植物表达载体p1301‑miR268导入农杆菌感受态细胞EHA105；6）经鉴定正确的阳性质粒p1301‑miR268，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤，操作如下：首先活化农杆菌，在含50 mg/L卡那霉素和40 mg/L利福平的YM培养基上划线，28 ℃暗培养；收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200 μM已酰丁香酮的AAM液体悬浮培养基中；调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0，倒入含继代培养1周的水稻愈伤组织的无菌三角瓶，侵染10 min，并不时晃动；然后将愈伤组织置于无菌的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25 ℃暗培养3天；将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5‑6次，再用含500 mg/L头孢拉定的无菌水清洗1~2遍，置于无菌滤纸上沥干1小时；将晾干的愈伤转入含500 mg/L头孢拉定和50 mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28 ℃，暗培养14天；然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500 mg/L头孢拉定和50 mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28 ℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25 ℃，12 h光照/12 h黑暗条件下培养；待再生小苗长成约1 cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗条件下培养；最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长；挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代植株，共21个株系；收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得纯合的转基因株系；所述的提取质粒是利用普通质粒小提试剂盒提取质粒，操作如下：取3 ml菌液加入离心管中，12000rpm离心1 min，尽量吸出上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl的含RNaseA溶液P1，彻底悬浮细菌沉淀；加入250 μl溶液P2，温和的上下翻转6‑8次使菌体充分裂解；加入350 μl溶液P3，立即温和的上下翻转6‑8次，充分混匀，12000rpm离心10 min；收集上清液，转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60 s，倒掉废液；加入600 μl已加入无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心60 s，倒掉废液并漂洗两次；将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2 min，置于室温彻底晾干；加入55 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中；所述的p1301‑miR268导入农杆菌感受态细胞EHA105的操作方法如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μg p1301‑miR268质粒，混匀，冰浴5 min，液氮中速冻5 min，37℃水浴5 min，然后加入1 ml YM培养基28℃恢复培养4 h；10000 g离心30 s，弃上清，吸200μl菌液涂布于含有50 mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48 h后长出农杆菌单菌落；摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α中，再提取质粒进行酶切鉴定。