[发明专利]一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法

摘要

本发明公开了一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，属于生物技术领域，生产方法包括将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；浓缩液经离子交换层析、疏水层析、一次膜过滤、脱毒、超滤和二次膜过滤得破伤风类毒素原液。本发明提供的一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法具有工艺简单、操作方便、生产效率高、成本低的优点，经本发明方法生产的破伤风类毒素成分更加单一、纯度更高，从而获得更好的免疫原性，降低接种副反应的发生。

主权项

一种层析纯化法生产破伤风类毒素原液的方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. 前处理：将破伤风杆菌培养液过滤，滤液经30KD的超滤滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/10，洗涤浓缩液并收集；S2. 离子交换层析：将上述浓缩液上样于平衡好的Q‑Sepharose Fast Flow层析柱，用15～25mmol/L PB、0.16mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱峰即为IEX毒素目标蛋白；S3. 疏水层析：向步骤S2中收集的洗脱液中加入等量15～25mmol/L PB、1.5～2.5mmol/L硫酸铵，并上样于平衡好的Phenyl FF层析柱，使用PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰即为HIC毒素目标蛋白；S4. 一次膜过滤：用PBS缓冲液稀释HIC毒素目标蛋白至600～800 Lf/ml，加入终浓度为20mmol/L的L‑赖氨酸盐酸盐，调pH为7.0～7.4，再加入终浓度为0.25%的甲醛溶液，滤膜过滤除菌；S5. 脱毒：将一次除菌过滤后的毒素分别在2～8℃的温度下放置1d、室温下2d、35～40℃的温度下21天进行脱毒，即为脱毒液；S6. 超滤：脱毒液经30KD的超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/20～1/15，洗涤浓缩液并收集；S7. 二次膜过滤：将步骤S6的超滤液经滤膜过滤除菌，滤液即为破伤风类毒素原液；其中，步骤S1、S6中所述洗涤浓缩液的方法为：用15～25mmol/L PB缓冲液反复清洗浓缩液，直至透过液在280nm下的吸光度达到恒定，收集洗涤后浓缩液；步骤S4中采用氢氧化钠溶液调pH为7.0～7.4；所述脱毒过程中每5～7天取样测定pH值，并使用氢氧化钠溶液调整脱毒液的pH值为7.0～7.4；步骤S4、S7中所述滤膜的孔径为0.2μm。