[发明专利]一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞

摘要

本发明公开了一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，对牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶获得的M‑S位点定点敲入Sp110基因的牛胎儿成纤维细胞。利用打靶载体中的MSR1启动子，使得定点敲入的Sp110在且仅在牛的外周血巨噬细胞中正常转录和表达。本发明利用电穿孔的方法将打靶载体和TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，通过PCR和Southern Blotting筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎。将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫中，最终生产成活的转基因克隆牛。

主权项

一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体，其特征在于，包括TALEN真核表达载体和打靶载体；所述的TALEN真核表达载体包括TALEN左臂表达载体和TALEN右臂表达载体，分别识别TALEN靶点的上游和下游识别位点，TALEN靶点位于牛基因组28号染色体SFTPA1和MAT1A基因的基因间序列；所述的打靶载体上克隆有重组基因MSR1‑Sp110‑PolyA，并克隆有作为同源臂的TALEN靶点上游和下游的同源序列；所述的重组基因MSR1‑Sp110‑PolyA是在Sp110基因的上游连接牛巨噬细胞特异性启动子MSR1，在下游连接PolyA；所述的TALEN左臂表达载体上克隆有TALEN左臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述的TALEN右臂表达载体上克隆有TALEN右臂，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；所述的重组基因MSR1‑SP110‑PloyA中，SP110的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，MSR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。