[发明专利]一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法

摘要

本发明涉及对双链核酸进行等温扩增及检测的方法，属于核酸检测领域。更具体的，涉及在切刻内切酶和聚合酶的联合作用下从双链核酸靶标扩增出单链靶标，并应用两条扩增引物和一条置换引物在等温条件下高效特异性扩增目标核酸的方法。本发明中通过对一条扩增引物与扩增模板退火区域的选择，实现了仅用三条引物就可完成对靶标核酸的高效特异扩增。并且模板的3’端与该引物完全互补，在提高了特异性的同时避免了传统技术中存在置换引物占据扩增引物互补位置而引起的阻滞扩增的问题。扩增引物还可以设计为分子信标的形式，只有被正确扩增的靶标序列才会与该种形式的引物退火并产生后续荧光信号，具有更好的特异性。

主权项

1.一种在等温条件下扩增检测双链核酸的方法，所述方法包括以下步骤：/n(1)切刻内切酶与DNA聚合酶联合作用于双链核酸靶标，循环扩增出单链或者5’端游离的悬垂片段，称为单链靶标；/n(2)扩增引物P1、置换引物B1先后与步骤(1)中产生的单链靶标退火；并在DNA聚合酶的作用下进行合成以及链置换合成，产生游离的由扩增引物P1延伸形成的产物，称为单链模板；/n(3)扩增引物P2与步骤(2)中游离的单链模板退火，在DNA聚合酶或者DNA聚合酶与切刻内切酶的共同作用下，单链模板与扩增引物P2相互以对方为模板延伸至5’端，形成完整双链核酸分子，下述均称为双链模板；/n(4)切刻内切酶与聚合酶联合作用于步骤(3)中的双链模板，循环扩增出可与扩增引物P1或P2互补的单链；/n(5)步骤(4)中扩增出的单链与扩增引物P1或P2退火，并在DNA聚合酶或者DNA聚合酶与切刻内切酶的共同作用下延伸成为双链核酸分子；/n(6)切刻内切酶和聚合酶联合作用于步骤(5)中产生的双链分子，循环扩增出可与扩增引物P2或P1互补的单链；该单链与与扩增引物P1或P2退火后又产生步骤(5)所述双链核酸分子；/n(7)重复步骤(5)和步骤(6)，以指数形式扩增产生核酸分子；/n所述扩增引物P1和P2上有切刻内切酶的识别序列和在反应条件下能与目标核酸互补的碱基区域；/n所述扩增引物P2与单链模板的3’端互补，两者退火后聚合酶能以单链模板3’端为起点合成DNA；/n根据反应温度确定扩增引物P1和P2的3’端退火区域碱基个数，所述退火区域的Tm值比反应温度高3～5℃；所述置换引物B1的Tm值比反应温度低2～3℃；/n所述方法为非诊断目的的方法。/n