[发明专利]抗鸭肝炎病毒转移因子的体外制备方法

摘要

本发明涉及一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法。本发明将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄鸡胚或鸭胚的尿囊液制备病毒抗原，提取鸭肝炎病毒抗原；然后以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养淋巴细胞，体外生产抗鸭肝炎病毒特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗鸭肝炎病，同时可以提高鸭的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸭肝炎病毒转移因子制备方法。

主权项

一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20‑30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置30‑60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2‑3次，离心速度800‑1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2‑3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于9‑11日龄的鸡胚或鸭胚尿囊液中，33℃‑37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融3‑5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15‑20min，4℃、5000rpm离心20‑30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心20‑30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心20‑30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、15000‑20000rpm离心2‑4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于‑20℃—‑40℃冰箱内保存备用；(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备：将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1000‑1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2‑3天后，8000rpm、20‑30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18‑24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。