[发明专利]一种生长抑素的合成工艺

摘要

本发明属于多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种十四肽生长抑素固相合成工艺的改进，步骤如下步骤1，将经溶胀处理的树脂和溶于DCM的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH和DIEA加入反应罐，搅拌反应以形成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂；步骤2，向上一步骤所得的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入DMF溶液，使物料脱去保护基团，加入溶解于DMF中的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH和缩合剂，搅拌反应以形成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；步骤3，循环步骤2去保护基团、保护氨基酸活化、偶联反应的操作，以形成十四肽树脂；步骤4，对上一步骤所得的十四肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，除去树脂，得还原型粗肽固体；步骤5，加水溶解粗肽固体，加碘的乙醇溶液氧化，形成环化十四肽；环肽溶液上制备液相纯化，再经冷冻干燥后，制得精肽。

主权项

一种生长抑素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)合成Fmoc‑Cys(Acm)‑树脂称取0.83kg，100‑200目，0.6mmol/g的2‑CTC树脂，加入DCM洗涤3次，每次10min，加入DCM，室温搅拌溶胀；加入用DCM溶解的Fmoc‑Cys(Acm)‑OH，加入330ml DIEA，通入惰性气体，于22.5±2.5℃条件下反应24小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，得到肽偶合树脂；(2)合成Fmoc‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Ser(tBu)‑OH，摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(3)合成Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(4)合成Fmoc‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Phe‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(5)合成Fmoc‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(6)合成Fmoc‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(7)合成Fmoc‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(8)合成Fmoc‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Phe‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(9)合成Fmoc‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Phe‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(10)合成Fmoc‑Asn(Trt)‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(11)合成Fmoc‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(12)合成Fmoc‑Cys(Acm)‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(13)合成Fmoc‑Gly‑Cys(Acm)‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Gly‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；(14)合成Fmoc‑Ala‑Gly‑Cys(Acm)‑Lys(Boc)‑Asn(Trt)‑Phe‑Phe‑Trp(Boc)‑Lys(Boc)‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Cys(Acm)‑树脂再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的摩尔量为树脂的2倍的Fmoc‑Ala‑OH、摩尔量为树脂的2倍的Cl‑HOBT，加入摩尔量为树脂的2倍的DIC溶解澄清，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，洗涤后用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到十四肽偶联树脂；(15)肽树脂的裂解取步骤(14)所得十四肽偶联树脂，按1g：10mL的比例加入裂解液，TFA：TIS的体积比＝95：5，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得还原型线性粗肽；(16)粗肽氧化加水溶解粗肽固体，将粗肽配成1mg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘，获得生长抑素粗品；(17)精制纯化初纯：流动相A：TFA/纯化水、B：色谱纯的乙腈，波长：230nm洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水；B相：乙腈，波长：230nm梯度洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min，洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min，在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束；收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干，即得。