[发明专利]小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法

摘要

本发明涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法，包括卵巢表面上皮细胞分离、早期传代、中期传代、晚期传代几个步骤，培养过程中的培养液依次采用选择性完全培养基、完全培养基和部分性完全培养基，选择性完全培养基、完全培养基均为包括胎牛血清、mEGF、以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的DMEM/F12培养液，部分性完全培养基为不含mEGF的DMEM/F12培养液；选择性完全培养基、完全培养基、部分性完全培养基中胎牛血清的浓度依次增大，选择性完全培养基中mEGF的浓度高于完全培养基中mEGF的浓度；本发明的小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法，没有转入致癌基因或使用其它诱导因素、有效解决正常野生型小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化这一问题。

主权项

一种小鼠卵巢表面上皮细胞体外恶性转化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1)卵巢表面上皮细胞分离：取6‑8周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，冲洗并剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜后，利用胰酶消化分离其卵巢表面上皮细胞，然后加入完全培养基以终止胰酶消化过程，离心弃上清液后再次加入选择性完全培养基并移入培养皿中在培养箱中孵育，孵育第2天避免移动培养皿，孵育第3天根据细胞生长情况采用半量换液法更换培养液，当卵巢表面上皮细胞密度达80％时，使用免疫荧光法检测上皮细胞标志物角化蛋白的表达，当其阳性率达95％以上且鹅卵石样立方上皮细胞达80‑85％以上时，进行下一步骤；2)早期传代：接种代数小于15代的卵巢表面上皮细胞，使用半量换液法按2：3至3：2比例传代，传代时间间隔5‑7天，培养液采用选择性完全培养基；3)中期传代：接种代数在16至84代之间的卵巢表面上皮细胞，16‑60代按1：2至1:4比例传代，60代后按1：5至1：8比例传代，传代时间间隔为3‑5天，培养液采用完全培养基；4)晚期传代：接种代数大于85的卵巢表面上皮细胞，按1：8至1：10比例传代，传代时间间隔为3‑5天，培养液采用部分性完全培养基。所述选择性完全培养基、完全培养基均为包括胎牛血清、mEGF、以及胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠的DMEM/F12培养液，所述部分性完全培养基为包括胎牛血清、胰岛素‑转铁蛋白‑亚硒酸钠且不含mEGF的DMEM/F12培养液；所述选择性完全培养基、完全培养基、部分性完全培养基中胎牛血清的浓度依次增大，所述选择性完全培养基中mEGF的浓度高于完全培养基中mEGF的浓度。