[发明专利]WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法

摘要

本发明公开了一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法，通过细胞培养、染色质免疫沉淀反应及数据分析、质粒构建与病毒转染、蛋白质印迹分析、细胞增殖能力测定、碱性磷酸酶和茜素红染色、裸鼠皮下进行细胞回植；发现WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用，以及在促进牙组织再生中的作用。本发明采用涉及组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化对间充质干细胞的基因活化和功能的调节作用、WDR63基因在间充质干细胞骨向/牙向分化过程中的调控作用、涉及WDR63基因在促进牙组织再生中的作用，得到WDR63可能在根尖牙乳头干细胞成骨分化中起促进作用。

主权项

1.一种WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法，其特征在于，该WDR63基因在间充质干细胞骨向和牙向分化过程中的调控方法包括：步骤一，细胞培养，智齿在用75%酒精消毒后再用磷酸盐缓冲盐水冲洗，分离和培养鉴定根尖牙乳头干细胞；步骤二，染色质免疫沉淀反应及数据分析，细胞于1%甲醛溶液中孵育15分钟，2×106个细胞以及抗组蛋白3第4位赖氨酸的三甲基化抗体用于此染色质免疫沉淀反应，所有产生的沉淀DNA样本采用实时定量pcr进行量化，数据表示为DNA的百分比；步骤三，质粒构建与病毒转染，标准方法进行质粒的构建，设计WDR63的SiRNA，将其插入慢病毒的shRNA载体上，测序鉴定，最终构建成WDR63shRNA的质粒；设计WDR63基因全长的PCR引物，用PCR的方法得到WDR63的全长将其连接到逆转录病毒的表达载体上，测序鉴定，最终构建成质粒；然后进行病毒包装、收集，病毒滴度鉴定，分装后保存在‑80度冰箱；病毒转染，对根尖牙乳头干细胞进行电镀过夜，然后感染逆转录病毒达6个小时，48小时后，用不同的抗生素筛选被转染的细胞；步骤四，蛋白质印迹分析，RIPA裂解液溶解细胞，样本用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离并利用半干转移膜装置转移到聚乙二烯二氟化物中，膜上涂抹5%脱脂牛奶放置2 h，然后用一抗孵育一夜；免疫复合物与兔或小鼠免疫球蛋白G抗体一同孵育并用化学发光底物试剂使其可视化；针对WDR63的一抗是抗WDR63多克隆抗体；步骤五，细胞增殖能力测定，根尖牙乳头干细胞1.0×104个细胞密度铺板 于60nm培养皿；并在细胞培养3、5、7天进行计数，细胞计数采用自动细胞计数仪并在细胞悬液中加入台盼蓝排除死细胞；进行3个独立实验取平均值；步骤六，碱性磷酸酶和茜素红染色，矿化诱导液诱导根尖牙乳头干细胞，碱性磷酸酶活性检测根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明进行分析，为检测矿化能力，细胞诱导2 ‑ 3周后，用70%乙醇固定，2%茜素红染色；定量测定钙离子浓度，用10%的氯化十六烷吡啶溶于磷酸钠在室温下使茜素红退色30分钟；钙离子浓度是通过测量562nm的吸光度决定，并用标准曲线换算；所述间充质干细胞为根尖牙乳头干细胞。