[发明专利]一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法

摘要

本发明阐述了一种新型结合诱变与高通量筛选高产重组酶菌株的方法，属于基因工程、酶学及发酵技术领域。采用ARTP诱变技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600宿主进行诱变，利用筛选平板初筛、96孔板高通量复筛、摇瓶发酵筛选验证的方式获得一株高产重组酶的突变株。以碱性淀粉酶为筛选模式酶，高通量筛选出产酶酶活力较高的突变株B.subtilis WB600-mutl2，发酵得酶活力为186.4U/mL，为出发株酶活的130.3％。过氧化氢酶在B.subtilis WB600-mut12中异源表达后，酶活力提高至出发宿主酶活的135.0％。该发明具有重要的实用与经济价值。

主权项

一种结合常压室温等离子(ARTP)诱变方式高通量筛选高产重组酶(如碱性淀粉酶)B.subtilis突变株的方法，其特征为：1)出发菌活化：将B.subtilis WB600进行划线培养，挑单菌落于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养8～20h后，转接新鲜LB培养基，进行同步培养；2)ARTP诱变处理：用无菌生理盐水洗涤菌体后再重悬菌体，适当稀释菌体浓度至10^6～8个/mL，吸5～15μL均匀涂于载片上，置于处理源下，进行诱变处理；3)后培养：诱变处理过的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，后培养2～3h后，适当稀释菌体浓度为10^5～7个/mL，涂布于新鲜的LB平板上培养；4)重组酶高产菌株筛选：将含有重组酶基因的重组质粒转化步骤3)中诱变获得突变体文库，得到含有重组酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库；将文库中的突变体逐个点种于筛选平板(对于该专利中突变宿主筛选采用的重组碱性淀粉酶，其筛选平板为淀粉‑台盼蓝营养平板)上，培养8～12h后观察透明圈大小，菌落小透明圈大的可能为高产碱性淀粉酶突变株；缩小筛选范围后，进行96孔板高通量筛选，最终进行摇瓶发酵验证高产菌株。