[发明专利]一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明提供了一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，本发明方法步骤包括鱼源无乳链球菌DNA的提取、引物设计、标准质粒模板的制备、荧光定量PCR退火温度的优化、绘制标准曲线、敏感性和特异性检测。本发明可以灵敏、快速、定量、特异性的检测出水产养殖动物感染无乳链球菌，灵敏度可达8.6细菌基因组拷贝/μL，对鱼类无乳链球菌病的预防有重大意义。

主权项

一种鱼源无乳链球菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于其检测方法的具体步骤如下：(1)提取鱼组织内的无乳链球菌DNA，制备检测液。(2)引物设计：根据GenBank中的鱼源无乳链球菌16S‑23S rRNA基因间区序列，通过Primer Premier6.0软件设计相应的特异性引物，序列如下：上游引物ISR‑s：5′‑GGAAACCTGCCATTTGCGTCT‑3′；下游引物ISR‑a：5′‑AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT‑3′。(3)标准品模板的制备：使用上述特异性引物扩增出大小为190bp的片段；通过连接、转化将该片段插入载体；最后对重组质粒进行鉴定。提取经过测序鉴定重组质粒，进行质粒浓度检测，计算出重组质粒的拷贝数，将质粒进行10倍稀释法稀释成6.04×10⁸、6.04×10⁷、6.04×10⁶、6.04×10⁵、6.04×10⁴、6.04×10³、6.04×10²、6.04×10¹拷贝/μL的8个浓度梯度，将其作为标准质粒模板，其中单位体积质粒溶液内的拷贝数计算公式如下：每μL质粒溶液的拷贝数＝[质粒浓度(g/μL)×阿伏伽德罗常数]/[重组质粒分子量×660]。(4)标准曲线制备：将标准质粒作为模板，构建反应体系，进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线和标准曲线。(5)将已经计算出拷贝数的重组质粒进行10倍梯度稀释，选取6.04×10⁴、6.04×10³、6.04×10²、6.04×10¹、6.04×10⁰、6.04×10^‑1拷贝/μL的6个浓度梯度，进行荧光定量PCR检测，以此确定荧光定量PCR所能检测的最低重组质粒拷贝数，验证本发明方法的敏感性。(6)分别以无乳链球菌感染的罗非鱼、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、海分枝杆菌、鰤鱼诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、哈维弧菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、健康罗非鱼和健康斑点叉尾鮰的DNA，以及人DNA标准品为模板，进行荧光定量PCR扩增，验证本发明方法的特异性。(7)样品中的无乳链球菌定量计算方法：在荧光定量PCR仪中直接读取待测样品的Ct值，将Ct值代入到标准曲线回归方程式，计算出无乳链球菌ISR的单拷贝数(X)。由于无乳链球菌的基因组内含有7个拷贝的ISR序列，则最终样品中的无乳链球菌拷贝数＝X/7。