[发明专利]一种快速筛选叶酸高产菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选叶酸高产菌的方法。该方法依据叶酸产量与流式细胞仪荧光信号之间的关系，采用荧光标记技术对诱变菌株进行载体复合、并利用流式细胞仪细胞表面展示技术检测含有不同产量叶酸的菌体发出的不同荧光信号，从而可以高效定位高产菌所在的荧光分布区域，为工业微生物菌种选育提供了参考，对发酵型叶酸的工业化生产具有一定的指导意义。

主权项

一种快速筛选叶酸高产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将酵母菌Y2.12 在22～32 °C下培养24小时进行活化，然后置于4 °C下保藏2～15 d，获得活化的酵母菌Y2.12的斜面保藏菌，通过控制菌种的斜面保藏时间，可以抑制菌体的生命活动，但不能使菌体进入休眠状态；（2）取上述斜面保藏菌接种于种子培养基中，在22～32 °C下摇瓶培养24～48 h，获得种子培养物；（3）将酵母菌液涂布于无菌平皿上，风干，进行N⁺或Ar⁺离子注入，洗脱后移至摇瓶种子培养基上22～32 °C培养2～4 d；（4）种液冰浴4～10 min，3000～8000 rpm离心4～10 min，沉淀采用不同方法制备得到感受态细胞，离心；（5）菌体经不同缓冲液制成悬液，加入0.5～15 μg/mL Rh123染料，暗处孵化5～60 min离心，去除多余的荧光染料，得到的沉淀菌体再经无菌去离子水清洗两次后制成一定浓度均匀悬液；（6）将染色好的样品放入流式细胞仪，通过530/40 nm带通滤片（FL1）检测荧光强度信号，以FL1‑H表示，检测1×10⁴个细胞，前向散射=E00，侧向散射=400～500, 激发波长=400～500 nm，发射波长=500～600 nm，得到流式细胞仪检测FCM图谱；（7）根据FCM图谱显示结果，用装有无菌发酵培养基的流式管接取不同荧光强度区域的菌体，分别在20～30 °C培养2～3 d后转接10 μL至甘油管中保藏，其余10 mL移至发酵培养基培养6 d后用HPLC检测产量，用于验证FCM检测结果的准确性。