[发明专利]一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法

摘要

一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，步骤为：一、对刺柏属物种的干燥叶片或种子，进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序；三、PCR扩增产物的纯化；四、对纯化产物进行测序反应；五、测序反应产物进一步纯化；六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或对核基因Chi1扩增的PCR产物，用遗传分析仪进行测序和数据收集；七、测序得到的原始序列峰图用软件打开，对测序质量高的个体读取碱基数据信息；原始序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏（JM）、方枝圆柏（JS）和西藏圆柏（JT）核基因Chi1的序列；八、分析和比对序列之间的差异程度，进行物种鉴定；具有鉴别快速和准确的特点。

主权项

一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，包括以下步骤：一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下：1)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10‑24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4℃的冰箱内；2)研磨胚乳或粉碎叶片：对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；3)粉末中加入800μL在65℃水浴中预热的2×CTAB溶液和8μL的β‑巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2×CTAB溶液中，将离心管置于65℃水浴锅中水浴45min，期间每隔10min上下颠倒混匀；4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm,4℃条件下离心10min；用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800μL氯仿‑异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min，以进行杂质的抽提；5)在转速10000rpm、4℃条件下离心10min，转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800μL氯仿‑异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min；6)在转速10000rpm，4℃条件下离心10min，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于‑20℃的冰箱中保存90min以上；7)取出后在4℃，转速12000rpm下离心10min，倒掉上层废液，再用70％乙醇漂洗沉淀2次，每次2‑4min，然后放在超净工作台上自然风干；8)在离心管中加入60μL双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4℃的冰箱内保存备用；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序，具体PCR扩增体系为25μL：包括2.5μL10×PCR buffer，0.5μL25mmol/L MgCl₂，5μmol/L正反向核基因Chi1引物各1.2μL，0.5μL10mmol/LdNTP，0.25μL5U/μLr‑Tag DNA聚合酶，10～50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；扩增程序为：先在94℃条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94℃条件下变性45秒，55℃条件下退火45秒，72℃条件下延伸2分30秒，最后72℃条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4℃的冰箱内，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量；三、PCR扩增产物的纯化使用纯化试剂盒CASpure PCR Purification Kit对PCR扩增产物进行纯化：1)在solution Ⅱ中加入4倍体积的无水乙醇；2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solution Ⅰ混合均匀，得到混合液；3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速10000rpm时离心1min；4)重复步骤3)一次；5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速10000rpm的条件下空柱离心2min；6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37℃时放置8‑12min以确保乙醇完全挥发干净；7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μL灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65℃预热，室温或37℃的水浴静置1min以上；8)转速10000rpm的条件下离心1min，此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量，于4℃条件下保存备用；四、对纯化产物进行测序反应纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，10μL的反应体系包括：Big Dye Terminator(ABI)2.5μL，正向或反向核基因Chi1引物5pmol，纯化后的模板产物25‑50ng，测序反应的条件如下：首先95℃条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95℃条件下变性15秒，50℃条件下退火15秒，60℃条件下延伸90秒，最后60℃条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4℃的冰箱内；五、测序反应产物的进一步纯化测序反应的产物按如下步骤进行纯化：1)加入25μL的醋酸钠，避光室温放置30min，在25℃、转速4000rpm的条件下离心30min；2)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；3)加入35μL的75％乙醇，立即在25℃、转速4000rpm的条件下离心15min；4)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；5)加入40μL的75％乙醇，立即在25℃、转速4000rpm的条件下离心15min；6)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；7)37℃的烘箱烘干半小时以上；8)取出后加入10μL甲酰胺；9)变性上机：95℃条件下变性5min，取出后快速放于冰上冷冻10min；10)纯化产物保存于4℃的冰箱内，待上机收集数据；六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或者对于Chi1基因扩增的PCR产物，利用遗传分析仪进行测序和数据的收集；七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体读取碱基数据信息；然后利用MEGA ver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)Chi1基因的序列：小子圆柏#292‑1‑JMCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA小子圆柏#292‑2‑JMCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA方枝圆柏#270‑1‑JSCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA方枝圆柏#061‑4‑JSCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA西藏圆柏#183‑1‑JTCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA西藏圆柏#222‑2‑JTCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA；八、分析和比对序列之间的差异程度，进行刺柏属小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)的物种鉴定；由序列比对和分析可以看出，刺柏属三个近缘物种在Chi1基因序列上存在明显的遗传差异，相互之间能够区分，方枝圆柏(JS)的两个个体270‑1‑JS和061‑4‑JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置处存在着特有的基因变异位点；小子圆柏(JM)的两个个体292‑1‑JM和292‑2‑JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置处存在着特有的变异位点；而西藏圆柏(JT)的两个个体183‑1‑JT和222‑2‑JT在165bp、281bp、197bp和281bp处存在特有的基因变异，这些特有的基因变异位点使得三个刺柏属物种之间能够准确区分；利用MEGA ver.6.0软件基于距离法进行系统进化树的构建，由系统进化关系树可得知，每个刺柏属物种的个体能够单独聚到一个独立的遗传分支上，对应于该物种本身，使得这些物种之间能够准确区分。