[发明专利]一种百合脱毒籽球的快速培养方法

摘要

本发明公开了百合脱毒籽球的快速培养方法，即通过在 35-38℃条件热处理栽种百合种球7-15 天、剥取热处理后百合种球茎尖生长点为外植体，接种于病毒唑 (Ribavirin) 含量 5-10mg/L的培养基中脱毒培养，用酶联免疫吸附测定实验(ELISA) 和 RT-PCR 检测对脱毒组培苗进行百合无症病毒(LSV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和百合斑驳病毒 (LMoV) 病毒病毒的检测，此发明通过综合脱毒技术确保培养出的百合籽球去除病毒感染，并优化了脱毒百合种球组培培养基成分和培养程序，快速培养得到脱毒组培籽球，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程领域技术。

主权项

一种百合脱毒籽球的快速培养方法，其特征在于，按如下步骤进行 ：(1)外植体灭菌和生长点的剥取：在 35‑38℃条件下种植百合种球，经过 7‑15 天的培养，待芽长高并绽开成莲座状，开始采集百合茎尖，用中性肥皂水清洗 3‑5 分钟，自来水冲洗过夜，0.1％升汞灭菌 5‑10 分钟，然后在 70％酒精浸泡 10‑15 秒；取出茎尖，先用加吐温灭菌水冲洗 2‑3 分钟，再用灭菌水冲洗 5‑6 遍；外植体清洗干净后，开始剥取生长点，先将茎尖的叶片全部剥除，用解剖针挑取百合茎尖生长点，生长点长度为 0.4‑0.8(mm)，将剥取的生长点立即接种；(2)脱毒培养：步骤①诱导培养，剥取的百合茎尖生长点接种到诱导培养基(1/2MS+6‑BA 1.0‑2.0mg/L+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖 + 琼脂粉 6g/L(pH 5.8))，经过 40‑60天培养，生长点膨大成直径 2‑3(cm) 的叶丛；②将叶丛切成 0.5(em) 小块，接种于含病毒唑的培养基 (MS+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖+ 病毒唑 (Ribavirin)5‑10mg/L+ 琼脂粉 5g/L+0.5％活性炭 (pH5.8))，经过 40‑60 天培养，形成带球的瓶苗；(3) 病毒检测：将步骤②瓶苗送到，农业部花卉产品质量监督检验测试中心 ( 昆明 )，经检测确认无任何病虫害现象并不带百合无症病毒 (LSV)、黄瓜花叶病毒 (CMV) 和百合斑驳病毒 (LMoV) 等病毒，才确认是百合脱毒种苗；(4) 脱毒籽球诱导培养 ：经过病毒检测，将步骤②脱毒瓶苗转移到籽球诱导培养基(MS+KT 2‑5mg/L+NAA0.2‑0.5mg/L+4％蔗糖 + 琼脂粉 5g/L+0.5％活性炭 (pH 5.8))，在温度22±1℃，光照强度 1500Lx，光照 12h/d 的环境条件下培养 40‑60d，直接诱导出脱毒籽球； (5)增殖培养：将步骤 (4) 组培籽球，切去叶片和部分基部组织后，纵切成3‑4 块直径0.3‑0.5cm 材料，接种于和籽球诱导培养相同的培养基上，在温度 22±1℃，光照 12h/d，光照强度 1000‑1500Lx 的环境条件下培养 2个月，可以扩繁3‑4 倍；(6)脱毒籽球在生物反应器内液体培养：将步骤 (5) 培养的组培籽球分开，形成单个的小籽球，大约直径0.3‑0.5cm，然后接种于反应器内；液体培养基(MS+NAA 0.2‑0.5mg/L+吡效隆 CPPU 1‑4mg/L+6％蔗糖 (pH 5.8))，在 22±1℃、1500Lx 和 2L/min 通气量条件下培养45 天，培养籽球直径可达 1.0‑1.4cm，根系在 3‑5 条 / 粒，籽球重 0.7‑1.2g/ 粒； (7)冷藏：取出步骤 (6) 培养的脱毒籽球，用清水冲洗掉培养液，包裹于消毒草炭中，经3‑4℃冷藏处理 30‑40 天打破休眠；(8)移栽驯化：将步骤 (7) 籽球取出，用 2000 倍阿米西达药液浸泡籽球 20 分钟，然后定植到 80‑90 穴的穴签中，穴盘基质 ：草炭 1 份、蛭石 1 份加少量促生根的菌肥拌匀装盘；定植后浇透水，并用地膜覆盖穴盘；放到网室内养护，昼温 20‑25℃，夜温 10‑15℃，盘土保持湿润，定植成活后，每周喷一次 1/2MS 营养液；(9)待籽球直径长到 2cm 以上，可选择具夏季冷凉气候的 800 ～ 1000 米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，3 月下旬至 4 月中旬定植到苗床里。