[发明专利]一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒

摘要

本发明提供了一种同时检测14个耳聋易感基因的PCR-LDR检测试剂盒，包括包装盒体(1)，PCR扩增和LDR反应试剂(2)-(5)；包括8对PCR引物、16组探针其中包括2组通用探针和14组检测探针。该方法灵敏度高，判读清晰准确；相对传统测序技术，本试剂盒能完成一次性获得14个关键耳聋基因突变诊断结果的高通量筛查，具有经济、高效和高准确率等优势。

主权项

一种同时检测14个耳聋易感基因的PCR‑LDR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包装盒体(1)，PCR扩增试剂(2)，LDR连接反应试剂(3)，基因分型试剂(4)，质控品(5)；所述PCR扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl₂，dNTPs的混合物Remix，EX‑Taq酶，8对引物混合物以及超纯水；所述LDR连接反应试剂包括：2组通用荧光探针及14组检测探针混合物，DNA连接酶，10X缓冲液及超纯水；所述基因分型试剂包括：ROX‑300内标，用于基因分型的14个耳聋基因突变位点对应的基因分型标准物；所述质控品包括：阴性质控品为灭菌的双蒸水，野生型质控品为经测序鉴定14个位点均为野生型的基因组DNA，阳性质控品为GJB2：235delC、299‑230delA＞T、176‑191 del 16，SLC26A4：IVS7‑2A＞G、2168A＞G、1226 G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点的突变质粒；使用所述的试剂盒进行复合PCR扩增反应的条件：PCR扩增体系的PH值为8.3‑8.9，镁离子浓度为1.5‑3mM，4种dNTP的终浓度为200‑300uM，Taq酶的用量为0.5‑1U，8对引物混合物中单对引物终浓度为0.5‑5uM，LDR探针混合物中，通用探针终浓度0.1‑0.5uM，14组检测探针终浓度为1‑5uM；使用所述试剂盒进行LDR‑PCR反应时，扩增阶段反应及LDR连接反应分别在一个复合体系中进行，同时扩增连接GJB2：235delC、299‑230delA＞T、176‑191 del16，SLC26A4：IVS7‑2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，线粒体12SrDNA：1555A＞G\1494C＞T，GJB3基因：538C＞T和WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A共计14个耳聋易感基因位点；所述试剂盒中包括PCR复合扩增使用8对引物，LDR复合体系使用16组探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针；用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191del16 3个基因位点检测的上下游引物目的片段长度为1136bp，其序列分别为：SEQ NO.1：G2F.GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTTSEQ NO.2：G2R.GAATCTATGTGTTGGGATATGGT用于IVS7‑2A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为450bp，其序列分别为：SEQ NO.3：IVS7‑2F，CACTGCTGGATTGCTCTCSEQ NO.4：IVS7‑2R.CAAATGGCTTGACGTTTGT用于2168A＞G位点检测的上下游引物目的片段长度为700bp，其序列分别为：SEQ NO.5：2168F，ATCACTTGAACTTGGGACACSEQ NO.6：2168R.CTGGGCTTCTTTGTGGCCT用于1226G＞A、1174A＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为885bp，其序列分别为：SEQ NO.7：1226‑1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGASEQ NO.8：1226‑1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG用于1975G＞C、2027T＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为287bp，其序列分别为：SEQ NO.9：1975‑2027F，TCTTCGTTTAGAATGGCAGCASEQ NO.10：1975‑2027R，ATTGCCAAAGCTCCAAACGT用于线粒体12SrDNA基因1555A＞G、1494C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为923bp，其序列分别为：SEQ NO.11：M‑F，gataccccactatgcttagccctaaSEQ NO.12：M‑R.ggtaggtttgtcgcctctacctataa用于GJB3基因538C＞T位点检测的上下游引物目的片段长度为600bp，其序列分别为：SEQ NO.13：GJB3F，CGTGTGGGGGGATGAGCAGSEQ NO.14：GJB3R，GCAGCGGCAGGTGGAAGC用于WSF1基因2158A＞G、2596G＞A位点检测的上下游引物目的片段长度为671bp，其序列分别为：SEQ NO.15：WSF1F，CTGACCTGGCAGCAGTATCGSEQ NO.16：WSF1R，AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC所述试剂盒使用16组LDR探针，其中包括2组通用探针，14组检测探针LDR通用模板1：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG通用荧光探针1：P‑GCATCACTCAGAGGG‑FAMLDR通用模板2：GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT通用荧光探针2：P‑TTAGCTTAACTGGCC‑HEX176‑191 del16检测探针序列为：GJB2_176_M：P‑TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTCGJB2_176_del：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCAGJB2_176_NOdel：TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC235delC位点检测探针序列为GJB2_235_M：P‑GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTCGJB2_235_delC：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAGJB2_235_C：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG299‑230delAT位点检测探针序列为GJB2_299_M：P‑GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTCGJB2_299_delAT：TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGJB2_299_AT：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT用于SLC26A4基因1975G＞C的检测探针序列为：1975_M：P‑AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC1975_C：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG1975_G：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC用于SLC26A4基因2027T＞A的检测探针序列为2027_M：P‑GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC2027_T：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA2027_A：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT用于SLC26A4基因1174A＞T的检测探针序列为：1174_M：P‑GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC1174_A：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT1174_T：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA用于SLC26A4基因1226G＞A的检测探针序列为：1226_M：P‑GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC1226_G：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC1226_A：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT用于SLC26A4基因IVS7‑2A＞G的检测探针序列为：IVS7‑2_M：P‑GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAACIVS7‑2_A：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCTIVS7‑2_G：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC用于SLC26A4基因2168A＞G的检测探针序列为：2168_M：P‑GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC2168 A：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT2168_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC用于12srRNA基因的1494C＞T的的检测探针序列为：1494_M：P‑GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC1494_C：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG1494_T：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA用于12srRNA基因的1555G＞A的的检测探针序列为：1555_M：P‑CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC1555_G：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG1555_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT用于GJB3基因的538C＞T的检测位点的探针序列如下：538_M：P‑TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC538_C：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG538_T：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA用于WSF1基因的2158A＞G，2596G＞A，2个检测位点的探针序列分别为：2158_M：P‑GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC2158_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT2158_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC2596_M：P‑GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC2596_G：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC2596_A：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT所述16组探针，其中2条通用探针5’端需进行磷酸化修饰，3’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料为不同的荧光素。