[发明专利]一种水中噬菌体分离方法

摘要

本发明公开了一种水中噬菌体分离方法，包括如下步骤(1)正电荷硅胶颗粒的制备；(2)洗脱液的配制；(3)噬菌体的分离，本发明的方法能够高效的分离各种水环境如自来水、地表水和污水中的噬菌体，分离效率高，对水中极低浓度的噬菌体(100PFU/100L)的分离效率达到了70％。本方法具有操作简便、快速及价格低廉等优点，因此该方法将加速从水环境中分离新的噬菌体的速度，为噬菌体的应用提供帮助。

主权项

一种水中噬菌体分离方法，其特征由如下步骤组成：(1)正电荷硅胶颗粒的制备①按比例，室温下称取6‑7g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)3凝胶，调节pH值至7.0‑7.5，加水定容至1000mL；在室温下静置18‑24h；②将步骤①获得的液体以1100g离心10‑30min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置18‑24h；③重复步骤②2‑4次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；④取1200‑1400g粒径为150‑300μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于50‑100℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；(2)洗脱液的配制称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、30‑40g甘氨酸和20‑30g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，调节pH为10.2‑10.5，在121℃下高压灭菌20min；(3)噬菌体的分离：①在层析柱中加入适量灭菌蒸馏水，再加入正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以300‑700mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；②当待测水样全部流过层析柱后，用相当于正电荷硅胶颗粒质量3‑4倍的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节pH为7.0‑7.5；加入PEG6000使质量浓度为10％‑15％并在搅拌下使PEG6000溶解，在常温下静置20‑40min，12000‑16000g离心20‑40min，弃上清液，用0.1MpH＝7.0‑7.5的PBS重悬沉淀并定容至10‑100mL得液体1，向液体1中加入10×液体培养基，所述10×液体培养基的加入体积为液体1体积的1/10，得液体2；③另取1mL10×液体培养基加灭菌生理盐水至10mL得1×液体培养基，将噬菌体的宿主菌接种至1×液体培养基中，30‑37℃下培养18‑24h；④取1mL步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，30‑37℃下培养18‑24h，然后3000‑4000g离心10‑20min，收集上清液，取1mL上清液与100μL步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中是否有噬菌斑出现；所述噬菌体的宿主菌为大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌或小肠结肠炎耶尔森菌。