[发明专利]一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法

摘要

本发明公开了一种诱导小鼠胚胎干细胞分化获得内耳毛细胞的方法，首先用条件培养液和诱导培养液诱导胚胎干细胞分化毛细胞前体细胞；然后利用诱导培养液与滋养层细胞结合的方法诱导前体细胞分化成熟内耳毛细胞；本发明所述方法能够有效诱导胚胎干细胞分化为内耳毛细胞前体细胞和成熟内耳毛细胞，分化比率高，分化所得细胞表达毛细胞特异基因和蛋白，并具备一定毛细胞电生理功能。

主权项

一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述的方法为：(1)将小鼠胚胎干细胞接种至条件培养液，在37℃、5％CO2条件下培养4‑5天，形成细胞团；取细胞团转移至诱导液Ⅰ中，在37℃、5％CO2条件诱导培养12‑14天，获得胚胎干细胞分化的毛细胞前体细胞；所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度30‑50％HepG2条件培养液、1mM非必需氨基酸、5μMβ‑巯基乙醇、2mM L‑谷氨酰胺、体积浓度10％FBS，溶剂为DMEM/F12基础培养液；所述HepG2条件培养液按如下方法制备：将HepG2细胞以5×104cells/cm2密度接种于培养皿中，按1.75×105cells/mL培养液的量加入含体积浓度10％FBS的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2条件下培养4‑5天后收集上层培养液，离心，取上层清液经抽滤，滤液即为HepG2条件培养液；所述诱导液Ⅰ终浓度组成为：体积浓度5％FBS、5‑15ng/ml IGF‑1、20‑30ng/ml EGF、1×N2、1×B27、45‑55ng/mL FGF3、45‑55ng/mL FGF10、45‑55ng/mL肝素钠，溶剂为DMEM/F12基础培养液；(2)将鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度2μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养液浸泡，在37℃，5％CO2培养箱中培养3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞；(3)将步骤(1)获得的毛细胞前体细胞进行消化处理，静置沉淀，弃沉淀，将细胞悬液接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上，加入诱导液Ⅱ，在37℃，5％CO2培养箱中继续诱导3‑4周，获得分化成熟的内耳毛细胞；所述诱导液Ⅱ终浓度组成：体积浓度5％FBS、20‑30ng/ml EGF、1×N2、1×B27、5‑15μM RA、5μM DAPT，溶剂为DMEM/F12基础培养液。