[发明专利]一种基于LAMP技术对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种对多菌灵高抗灰葡萄孢菌株的快速检测方法，可用于引起作物灰霉病的灰葡萄孢菌对多菌灵的抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高和成本低廉的分子检测技术。该检测方法通过在灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株的β微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株。LAMP扩增产物显示为天蓝色，电泳图谱呈梯状条带，有产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株；LAMP扩增产物显示为紫色，电泳图谱无条带，无产物扩增，鉴定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非高抗菌株。本发明简便、快速、成本低，对作物灰霉病的抗性风险评估及合理用药具有重要的现实意义。

主权项

一种基于LAMP技术快速检测灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株的分子生物学方法，该方法共分三步：(1)运用两对特异性引物对待测样品的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两对特异性引物的碱基序列分别是：LAMP反应所用的外引物对：F3：5’‑GCAACTCTCTCTGTCCATCAA‑3’B3：5’‑GCCAACTTTCGGAGATCTGA‑3’LAMP反应所用的内引物对：FIP：5’‑GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCAGGTTGAGAACTCTGACAYGAC‑3’BIP：5’‑TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCGAAGTTGACCAGGGAAACGG‑3’反应体系：反应参数：62℃60min，80℃10min；(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；(3)鉴定是否为灰葡萄孢菌对多菌灵高抗菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱应为梯状条带，判定为灰葡萄孢菌对多菌灵的高抗菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增，判定为灰葡萄孢菌对多菌灵的非高抗菌株。