[发明专利]腈水合酶及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种腈水合酶及其编码基因和应用，该腈水合酶由α亚基和β亚基组成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明从产酸克雷伯菌KCTC 1686中克隆到腈水合酶基因，该基因表达后成功获得具有高表达量和高活性而且底物谱广、具手性选择性的腈水合酶。

主权项

一种利用腈水合酶催化2‑(4‑氯苯基)‑3‑甲基丁腈生成2‑(4‑氯苯基)‑3‑甲基丁酰胺的方法，其特征在于，所述腈水合酶的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.7所示；所述方法，包括以下步骤：(1)克隆腈水合酶和其激活子基因：根据Klebsiella oxytoca KCTC 1686基因组DNA序列设计引物NH‑F和NH‑R，所述DNA序列的GenBank登录号为CP003218.1；NH‑F序列：5’‑CCGGAATTCATGAGCCATAAACACGACCACG‑3’；NH‑R序列：5’‑TTCCCAAGCTTGTTATGGTGTAACTCCATTATCG‑3’；以Klebsiella oxytoca KCTC 1686基因组DNA为模板，NH‑F和NH‑R为引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化回收；(2)表达载体和工程菌的构建：将纯化回收后的目的片段和提取的pET‑30a(+)空质粒分别用限制性内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切；之后用DNA回收纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段；再用T4DNA连接酶将目的片段与pET‑30a(+)质粒进行连接；之后用连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，涂平板、挑单菌落进行LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子；从E.coli DH5a阳性转化菌株中提取重组质粒pET‑30a(+)‑NHaseK，并用其转化表达宿主E coli BL21(DE3)感受态细胞；验证无误后的基因工程菌即为E.coli BL21(DE3)/pET‑30a(+)‑NHaseK；(3)重组腈水合酶的表达：将构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET‑30a(+)‑NHaseK接于5mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；取1mL培养液转接至50mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，20℃下诱导18h；(4)基因工程菌催化2‑(4‑氯苯基)‑3‑甲基丁腈生成2‑(4‑氯苯基)‑3‑甲基丁酰胺：取25ml工程菌E.coli BL21(DE3)/pET‑30a(+)‑NHaseK的发酵液，10000rpm,10min离心收集菌体，用250ml 50mM Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲液重悬菌体细胞，即得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET‑30a(+)‑NHaseK的静息细胞悬液；向静息细胞悬液中加入1.0g 2‑(4‑氯苯基)‑3‑甲基丁腈，35℃下进行水合反应，反应30min。