[发明专利]一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺

摘要

本发明涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，通过对单环刺螠体腔液冷冻离心、抽滤、真空冷冻干燥制得粗制品，进一步经过DEAE(二乙氨基乙醇)-Sepahcel(纤维素葡聚糖凝胶)阴离子交换层析和Sephadex(羟丙基葡聚糖凝胶)G-75层析、Benzamidine(苯甲脒)-Sepharose(琼脂糖凝胶)层析、冷冻干燥后经进一步测定证实为纤溶酶，后在大鼠脑颈内动脉栓塞模型上通过介入溶栓实验证实，单环刺螠纤溶酶具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。

主权项

一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，其特征在于：(1)取鲜活单环刺螠，收集其体腔液，将温度控制在‑20℃‑4℃之间、离心力控制在2000g‑10000g之间进行冷冻离心30‑35分钟，抽滤30‑40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8‑10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；(2)将粗制品溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在‑20℃‑4℃之间、离心力控制在2000g‑10000g之间进行冷冻离心30‑35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cm×15cm的DEAE‑Sepahcel阴离子交换柱、并用50‑800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；(3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的Sephadex G‑75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56‑3备用；(4)将上述备用样品A56‑3溶解在50mM Tris‑HCl(三羟甲基氨基甲烷‑盐酸)、400mM NaCl、pH＝7.4的缓冲液中，注入经50mM Tris‑HCl、400mM NaCl、pH 7.4缓冲液平衡的Benzami dine‑SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用100mM glycine‑HCl(甘氨酸‑盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL 0.5M Tris‑HCl(三羟甲基氨基甲烷‑盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺螠纤溶酶A56‑3‑2。