[发明专利]一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法

摘要

本发明公开了一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，属于生物检疫的技术领域。该方法用MDBK细胞系繁殖BVDV，再用间接免疫荧光方法检测病毒，具体包括S1.MDBK细胞的培养；S2.BVDV的接种；S3.间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒：洗涤、丙酮固定、一抗孵育、二抗孵育和结果判定。本发明方法能够快速、准确检测出BVDV粒子的活性，稳定检测出猪瘟活疫苗中污染的BVDV，应用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的检测，为制备纯净的猪瘟弱毒活疫苗提供更有效的检测方法。

主权项

一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. MDBK细胞的培养将长满单层的MDBK细胞，用胰酶消化后，加入生长液制成细胞悬液以2～4×10⁵个/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃ 5% CO₂的条件下培养，24h后细胞贴壁铺满孔底；其中，所述生长液为含有10%马血清的MEM培养基；S2. BVDV的接种用步骤S1培养的MDBK细胞接种BVDV，添加含2%的马血清至每孔200μl，培养72h，同时设不接种BVDV的MDBK细胞作为阴性对照；S3. 间接免疫荧光检测牛病毒性腹泻病毒    S31.洗涤： 将灭菌预冷的PBS洗去96孔板细胞残留的生长液，洗涤2～3次，每次4～6min；    S32.丙酮固定：用丙酮固定30～60min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；    S33. 一抗孵育：用PBS稀释羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；    S34. 二抗孵育：再用PBS稀释兔抗羊IgG FITC二抗，湿盒37℃孵育45～90min，PBS冲洗洗涤2～3次，每次4～6min；    S35. 结果判定：将96孔板放在倒置显微镜上观察，判定结果。