[发明专利]一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法在审
| 申请号： | 201410695848.0 | 申请日： | 2014-11-26 |
| 公开（公告）号： | CN104480100A | 公开（公告）日： | 2015-04-01 |
| 发明（设计）人： | 方柏山;陆吉学 | 申请（专利权）人： | 厦门大学 |
| 主分类号： | C12N11/12 | 分类号： | C12N11/12;C12N15/70;C12P13/04 |
| 代理公司： | 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 | 代理人： | 张松亭 |
| 地址： | 361000 *** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种固定化耦联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)制备纤维素载体；(2)制备固定化耦联双酶；(3)将上述固定化耦联双酶与底物和辅酶在pH＝6.0～11.0的NH4Cl-NH3缓冲体系中反应，制备L-叔亮氨酸。本发明的方法利用生物工程菌构建固定化耦联在纤维素载体上的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶来生产L-叔亮氨酸，产品转化率高，反应条件温和，操作简单，昂贵的辅酶可再生，酶可回收利用，提高了酶的利用效率，适合工业化生产。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 固定 化耦联双酶 制备 亮氨酸 方法 | ||
【主权项】：
一种固定化耦联双酶制备L‑叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)制备纤维素载体；(2)制备固定化耦联双酶：具体包括：1)构建对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌，上述对接模块标记的亮氨酸脱氢酶基因序列如SEQ ID 1所示，2)构建对接模块标记的甲酸脱氢酶基因的E.coli工程菌，上述对接模块标记的甲酸脱氢酶基因序列如SEQ ID 2所示，3)构建支架蛋白基因的E.coli工程菌，上述支架蛋白基因序列如SEQ ID 3所示，4)依次通过培养、IPTG诱导表达和超声破胞，分别分离获得步骤1)、2)和3)构建的E.coli工程菌中表达的对接模块标记的亮氨酸脱氢酶、对接模块标记的甲酸脱氢酶和支架蛋白；5)将上述获得的对接模块标记的亮氨酸脱氢酶、对接模块标记的甲酸脱氢酶、支架蛋白和纤维素载体混合并在10～40℃吸附10～100min，离心弃上清液，沉淀用含有0.5～50mM的CaCl2和NaCl且pH为6.0～11.0的HEPES缓冲液洗涤，获得固定化耦联双酶；(3)将上述固定化藕联双酶与底物和辅酶在pH＝6.0～11.0的NH4Cl‑NH3缓冲体系中反应，制备L‑叔亮氨酸。
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