[发明专利]一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法

摘要

本发明提出了代谢工程改造和发酵工艺相结合的策略，一方面通过代谢工程手段转变代谢流从糖酵解途径流向L-丝氨酸合成途径，提高了L-丝氨酸的糖酸转化效率；另一方面通过添加营养成分满足代谢改造后导致的谷氨酸棒杆菌对营养物质的需求，解决菌体生长缓慢的问题，提高L-丝氨酸的生产强度。

主权项

一种高产L‑丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征为：分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化，最后获得重组谷氨酸棒杆菌SYPS‑062‑33a ∆SS ∆avtA ∆C‑T ilvN：(1)基因扩增：根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌SYPS‑062‑33a ∆SS基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至pMD19‑T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性；(2)重组敲除质粒的构建：将所述步骤(1)中的连接有目的片段进行双酶切处理，将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK18mobsacB，转化至E.coli JM109感受态细胞，筛选验证阳性克隆；(3)基因的重组整合：提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒pK18mobsacB‑geneX，电激转化至谷氨酸棒杆菌SYPS‑062‑33a ∆SS及其系列衍生菌株感受态细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株；(4)重组菌株的验证：利用引物通过PCR扩增验证重组菌株； 重复上述实验即可获得了重组谷氨酸棒杆菌SYPS‑062‑33a ∆SS ∆avtA ∆C‑T ilvN。