[发明专利]一种土壤微生物基因组的提取方法

摘要

一种土壤微生物基因组的提取方法，采用Ca(OH)2水溶液、磷酸盐和NaOH溶液对土壤进行预处理使土样分散均匀释放被土质包裹的细胞，用溶菌酶、蛋白酶k和SDS共同作用裂解细胞，氯仿/异戊醇变性蛋白质，乙醇沉淀DNA得到粗提物，再用BaCl2和CaCl2混合液对粗提DNA溶液处理进一步去除腐殖酸等杂质，再用乙醇沉淀得到纯化的基因组DNA。采用本方法得到的DNA纯度和产量均可用于后续PCR等操作中，并且可在4h之内完成，使用常规试剂，不仅大大节约了时间，而且适合在实验室进行。上述提取方法也适用于其他土质如粘性土壤和沙质土壤，也适用于河底污泥等。

主权项

一种土壤微生物基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将土壤加入到离心管中，并加入氢氧化钙水溶液，振荡使土样分散，得到土壤混合液；其中，土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为（5‑10）g：（10‑20）mmol；（2）向土壤混合液中加入磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液，振荡使土壤中的细胞释放，然后进行离心，收集沉淀；其中，土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为（5‑10）g：（0.1‑0.25）mmol：（0.1‑0.25）mmol；（3）向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液，然后于60‑70℃下加热后得到溶液A；其中，沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的加入量比为（0.5‑1.5）g：（500‑1500）μL：（30‑90）μL：（20‑60）μL；（4）向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡至溶液变成乳浊液后进行离心，吸取上清液；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8‑1.2倍；（5）向上清液中加入乙醇水溶液并进行离心，将所得沉淀晾干或烘干，得到DNA粗提物，将DNA粗提物进行纯化，得到基因组DNA；所述将DNA粗提物进行纯化的具体过程为：将DNA粗提物溶解于无菌水中，然后加入洗涤液并进行离心，吸取上清液A；向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物，震荡混匀，并于4℃下离心，吸取上清液B，向上清液B中加入乙醇溶液，并于4℃下离心，所得沉淀即为基因组DNA；其中，氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8‑1.2倍；氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；所述步骤（3）中DNA提取液为 10mmol/L pH值为7.5的Tris‑HCl，10mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，质量分数为5%的SDS；溶菌酶溶液的浓度为40‑60mg/mL，蛋白酶k溶液的浓度为20‑30mg/mL；所述洗涤液为BaCl2和CaCl2的水溶液，且水溶液中BaCl2与CaCl2的总浓度为0.5‑1mol/L，且BaCl2与CaCl2的摩尔比为1:1、2:1或1:2；所述步骤（1）中Ca(OH)2水溶液的浓度为1‑2mol/L；振荡的时间为2‑5min；所述步骤（2）中磷酸盐水溶液和氢氧化钠溶液的浓度均为0.1‑0.2mol/L；磷酸盐为磷酸钠或磷酸钾；步骤（1）中振荡的时间为5‑10min；该提取方法提取的基因组DNA产量达90μg/g土壤。