[发明专利]一种运动发酵单胞菌原生质体的制备与再生方法

摘要

一种运动发酵单胞菌原生质体的制备与再生方法，包括制备该菌斜面培养基，菌体活化，种子培养液的制备，细胞壁的酶解，原生质体悬浮液的制备，原生质体的再生，本发明所采用的原生质体制备与再生，对运动发酵单胞菌的原生质体制备率最高可达90.0％，再生率可达22.4％，本发明制备过程中操作简单，具有可重复性，制备率高，原生质体活性保持较好，有利于后续的融合子的制备和筛选。

主权项

一种运动发酵单胞菌原生质体的制备方法，包括下述步骤：步骤一，制备Z.mobilis斜面培养基：将Z.mobilis培养基装入试管，每个试管装入培养基的体积为15mL，倾斜放置成斜面培养基备用；步骤二，活化菌体：取保存有Z.mobilis菌种干粉的安瓿管，安瓿管内Z.mobilis干粉的质量为1.00g，用浸过75％(v/v)酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端至红色，滴1.00mL无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或镊子敲下已破裂的安瓿管顶端，用无菌吸管吸取0.50mL的无菌水，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使菌体溶解呈悬浮状得到菌体悬浮液，在步骤一中每个试管斜面培养基上涂布250.00μl菌体悬浮液，30‑35℃无氧条件下培养48‑72h，得到菌体：步骤三，制备种子培养液：取步骤二中得到的菌体接种于新鲜细菌液体培养基中，30‑35℃，厌氧条件下，静置培养12h，获得种子培养液；步骤四,细胞壁的酶解取步骤三中得到的种子培养液100.00μl转入1mL新鲜细菌液体培养基中静置培养12h，再加入浓度为1.00‑10.00g/l的甘氨酸溶液3.00mL，然后将全部液体离心收集菌体，具体地，先用1.00mL的P液洗涤1次，离心收集菌体，再将收集的菌体移入10.00mL浓度为0.80g/l的EDTA高渗溶液中，30‑35℃，预处理30min，再次离心收集菌体；向收集的菌体中加入2.00mL的P液，振荡，制成悬浮液，向悬浮液中加入10.00mL溶菌酶液，30‑35℃酶解12h，得到酶解液；所述溶菌酶液中溶菌酶中的作用浓度为1.00‑10.00g/l；步骤五,原生质体悬浮液的制备：将步骤四得到的酶解液离心，使得原生质体与酶解液分离；弃其上清液，用1.00‑2.00mL的S液，离心洗涤2‑3次，收集的原生质体重悬于1.00mL的S液中得到原生质体悬浮液；其中：所述P液的组成为：0.30mol氯化钾，0.30mol蔗糖，磷酸缓冲液1000.00mL，pH6.0；所述S液的组成为：蔗糖180.00‑200.00g，葡萄糖20.00‑30.00g，酵母膏5.00‑10.00g，磷酸二氢钾1.00‑2.00g，硫酸镁1.00‑2.00g，蒸馏水1000.00mL，pH6.0；所述溶菌酶液的组成为：溶菌酶1.00‑10.00g，S液1000.00ml；所述EDTA溶液的组成为：EDTA 0.80g，P液1000.00mL；所述新鲜细菌液体培养基的组成为：葡萄糖100.00g，酵母膏5.00g，磷酸二氢钾1.00g，硫酸镁0.50g，硫酸铵1.00g，蒸馏水1000.00mL。