[发明专利]一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于G-四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法及试剂盒，属于基因工程技术领域，其利用核酸等温扩增（NASBA）体系对目标RNA进行扩增得到单链的RNA产物；将上、下游探针和RNA扩增产物加入到G-四链体荧光检测缓冲液中，经变性、退火后再加入原卟啉，利用酶标仪或荧光光度计检测该反应体系中荧光强度，可判定样品中有无猪瘟病毒存在。本发明检测猪瘟病毒速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、成本低廉。

主权项

一种基于G‑四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法，包括以下步骤：（1）NASBA扩增： 将纯化好的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系中，体系包括0.5‑1μM正向引物和0.5‑1μM反向引物；反应步骤：65℃ 变性后降温，然后加入NASBA酶反应液进行等温扩增反应，条件为： 41℃90分钟，得到RNA扩增产物；其中：NASBA反应缓冲液体系包括NASBA反应缓冲液、NASBA正向引物和反向引物； NASBA反应缓冲液，包括：30‑60mM Tris‑HCl(PH8.0); 60‑80mM KCl；10‑30mM MgCl2；0.5‑2mM脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）; 0.5‑2mM 核糖核苷三磷酸（NTPs）；5‑20mM 二硫苏糖醇；5‑20%（v/v） 二甲基亚砜（DMSO）；NASBA正向引物和反向引物，包括，0.5‑1μM正向引物（E2P7f）： ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT；0.5‑1μM反向引物（E2P7T7r）：GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAAC ACTACCTCACCC T；NASBA酶反应液，包括：T7RNA聚合酶40‑80U；AMV逆转录酶2‑10U；RNA酶（RNAseH） 0.05‑0.15U，0.5‑5μg的牛血清白蛋白（BSA） ；（2）G‑四链体荧光检测反应：取G‑四链体荧光检测反应缓冲液，反应缓冲液的组成包括上游探针0.5‑2μM和下游探针0.5‑2μM，加无菌双蒸水补足为96μl，加入2μl的RNA扩增产物；然后85℃变性3 min后降温；加入原卟啉0.5‑2μM，然后将溶液转移到96孔酶标板中，将酶标板放入酶标仪，以399nm波长的光源激发，检测610nm波长处发射的荧光；检测到的荧光强度高于3.0×107U即可判断为猪瘟病毒阳性国；其中：G‑四链体反应缓冲液的组成包括：10mM 的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸， 200mM的氯化钠和20mM的氯化钾；上游探针0.5‑2μM和下游探针0.5‑2μM。