[发明专利]一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法

摘要

本发明公开一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，具体步骤如下（a）制备根分泌液；（b）收集休眠孢子液；（c）制备感受态休眠孢子液；（d）芸薹根肿菌遗传转化；（e）博莱霉素抗性筛选，重复接种筛选三代后，即获得稳定遗传转化孢子；本发明实现了PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌的遗传转化，获得了高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率达到1000个转化子/mg DNA（以单位质量的DNA计），此外，本发明转化所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子RP27，有效提高了转化菌株的荧光强度。

主权项

一种PEG/LiAc介导的芸薹根肿菌遗传转化方法，其特征在于，包括休眠孢子悬浮液的收集和芸薹根肿菌的遗传转化，其具体步骤如下：（a）制备根分泌液：将催芽2‑3d的幼苗播种在Hoagland营养液中，24℃/18℃光暗交替培养，7d后将收集到的根分泌液用0.22um细菌过滤器过滤，即获得根分泌液；（b）收集休眠孢子液：将芸薹根肿病根切碎后搅成匀浆，以8层纱布过滤后，滤液以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入质量分数为50%的蔗糖溶液，500rpm离心5min，取上清液和上层灰色层；将上清液和上层灰色层以6000rpm离心10min，取沉淀；向沉淀中加入ddH₂O重悬，6000rpm离心10min，取沉淀，重复加入ddH₂O离心三次，向第三次获得的沉淀中加入ddH₂O，再加入硫酸粘杆菌素和盐酸万古霉素至终浓度均为1ug/ml，24℃黑暗培养24h后，再以6000rpm离心10min，取沉淀用ddH₂O洗涤三次后，向沉淀中加入步骤a获得的根分泌液重悬至孢子浓度为5×10⁸个/ml，即获得休眠孢子液；（c）制备感受态休眠孢子液：将步骤b获得的休眠孢子液于24℃以60rpm震荡培养6h，6000rpm离心5min，取沉淀悬浮于0.1M TE/LiAc溶液，37℃，60rpm震荡培养30min，获得感受态休眠孢子液；（d）芸薹根肿菌遗传转化：将带有绿色荧光蛋白eGFP的质粒pYF11‑GFP‑GFP和鲑鱼精DNA加到步骤c获得的感受态休眠孢子液中，冰浴1h后，加入PTC缓冲液，24℃黑暗培养1h，再加终浓度为300ug/ml的博莱霉素，24℃黑暗培养3h，然后2000rpm离心5min；取沉淀，向沉淀中加入STC缓冲液重悬，然后2000rpm离心5min，重复离心两次，取第二次离心获得的沉淀，加入ddH₂O调整孢子浓度至5×10⁸个/ml，即获得遗传转化孢子液；（e）博莱霉素抗性筛选：将步骤d获得的遗传转化孢子液接种寄主，60d后收集病根休眠孢子液，经300ug/ml的博莱霉素24℃培养24h后，用ddH₂O洗3次，调节孢子浓度5×10⁸个/ml，再次接种寄主，重复接种筛选三代后，所获得的休眠孢子液中的孢子即为稳定遗传转化孢子。