[发明专利]一种提取梨花粉管液泡的方法

摘要

本发明公开了一种分离纯化梨花粉管液泡的方法，主要包括花粉采集、花粉培养、原生质体释放、原生质体纯化、液泡分离、液泡纯化等步骤。该方法用中性红2次染色方法可在光学显微镜下清楚地区分花粉粒、液泡、原生质体和水泡。本发明的优点在于提取方法快速、简单，液泡膜表面光滑，污染程度小，所需材料和药品极少，不仅可以应用于膜片钳研究，还可以进一步应用于液泡蛋白质组学研究。

主权项

一种提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23～27 ℃，140~200 rpm，培养3~4 小时；所述的花粉培养基配方为：100 g/L蔗糖，0.3 g/L Ca(NO3)24H2O，30 mM MES，0.1 g/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5.9~6.4；2）原生质体的释放：将培养好的花粉与胞外液按照1:2~5的体积比混合，加入0.5~1.5%的纤维素酶、0.5~1.5%的离析酶，23～27 ℃，黑暗条件下，60~80 rpm，反应10~15分钟；所述的胞外液配方为：100 mM 葡萄糖，10 mM CaCl2，5 mM MES，0.8‑1M山梨醇，用Tris将pH调至5.5~6.0；3）原生质体的纯化：将上一步所得含原生质体的液体通过200‑250目的细胞筛去除未酶解的花粉管，滤液加入到离心管中，静置2‑5分钟后吸取上清，上清液离心，去除上清液，再用胞外液清洗沉淀去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；4）液泡的分离：将液泡溶解缓冲液加入到上一步获得的花粉管原生质体中，用移液枪吸打3‑5次，静置5‑10分钟，观察液泡出现情况；液泡溶解缓冲液配方为：0.3‑0.35 M山梨醇，2‑4 mM EDTA，2‑5 mM DTT和0.005%的中性红，用Tris将pH调至7.5~8.0；5）液泡的纯化：将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll‑400密度梯度工作液顶部离心，在25000~28000 rpm、8~10℃下离心15‑30分钟；离心后，Ficoll‑400密度梯度工作液12~15% 浓度顶部淡红色的一层为液泡，将其吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为所述的梨花粉管液泡；所述的Ficoll‑400密度梯度工作液浓度分别为：2~4%、6~8%及12~15%。