[发明专利]一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法

摘要

本发明提供一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体的方法，该方法包括下列步骤：琼脂糖凝胶Sepharose 6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose 6B凝胶；人血浆载脂蛋白A-I免疫亲和柱的制备成Sepharose 6B-人血浆载脂蛋白A-I蛋白免疫亲和柱；使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2～8℃密封保存；纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体。本发明应用免疫亲和柱纯化人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体，通过一次性纯化即可去除绝大部分杂质，有效的消除了免疫比浊试剂中的伪浊度问题。本发明方法可以简便、高效、特异性地从血清中分离纯化羊抗人血浆载脂蛋白A-I多克隆抗体，有较大的应用价值。

主权项

一种纯化羊抗人血浆载脂蛋白A‑I多克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：1)琼脂糖凝胶Sepharose 6B的活化：用溴化氰法活化Sepharose6B凝胶，活化过程如下：a)取10ml Sepharose 6B放在布氏漏斗中抽干，用30ml去离子水分两次洗涤后抽干，再加入少量0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；b)在通风橱内称取1g溴化氰，加去离子水10ml溶解，然后分批加入Sepharose 6B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH,使得pH维持在10.5，待溴化氰溶液滴加完毕，继续搅拌30分钟，pH保持不变，停止搅拌；c)将活化的Sepharose 6B加入小冰块，迅速导入布氏漏斗中，以冰水抽滤，并调节pH7，再迅速以150ml冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO₃溶液抽洗备用；2)人血清前白蛋白免疫亲和柱的制备：人血清前白蛋白与琼脂糖凝胶Sepharose 6B偶联得到亲和吸附填料，填入玻璃柱中制得人前白蛋白免疫亲和柱，操作步骤如下：c)偶联以纯化制备获得的人血浆载脂蛋白A‑I纯品作为配基，采用GE AKTA^TM快速蛋白层析仪purifier100系统HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成亲和偶联缓冲液体系：pH8.3的内含有0.5M NaCl的0.1mol/LNaHCO₃偶联缓冲液；步骤1)活化好的Sepharose 6B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入人血浆载脂蛋白A‑I蛋白溶液中进行偶联，蛋白检测仪监控偶联过程；用10倍体积以上的偶联缓冲液去除未偶联的人血浆载脂蛋白A‑I溶液，得到Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白偶联复合物；收集全部洗脱液，通过测定其蛋白质含量计算偶联率；d)封闭活性基团将Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白偶联复合物转入5倍体积pH8.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液中，旋转震荡约2h,以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；e)洗涤步骤1)得到的Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白偶联复合物依次用10倍偶联复合物体积的pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L醋酸‑醋酸钠缓冲液和5倍体积的pH8.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris‑HCl缓冲液中洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用10倍偶联复合物体积的PBS洗涤2次；f)装柱将上述得到的Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白偶联复合物填充5ml或10ml固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白免疫亲和柱；g)保存步骤(f)制备好的Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白偶联复合，使用含有万分之二叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，2～8℃密封保存；3)纯化羊抗人血浆载脂蛋白A‑I多克隆抗体：取免疫后羊抗人血清人血浆载脂蛋白A‑I抗血清200ml，依次用0.8um、0.45um微孔滤膜过滤，滤液过制备的Sepharose 6B‑人血浆载脂蛋白A‑I蛋白亲和柱，柱子用含50ml的PBS预处理：分别用50ml含0.5M NaCl的PBS淋洗杂质组分，紫外检测器检测吸光度平衡后，用pH4.0的内含有0.5M NaCl的0.1mol/L Tris‑柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱液经HiTrap^TM Desalting脱盐柱置换成PBS缓冲液后，自动生化仪AU400上机，标准品定标测试，观察定标曲线的线性。