[发明专利]一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法

摘要

本发明公开了一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法。本发明是以活性酯法将肟化他达那非与牛血清白蛋白偶联，合成人工免疫抗原，并用于免疫动物，制备特异性抗他达那非及其类似物抗体。另外将肟化他达那非与卵清白蛋白偶联，用于构建免疫检测方法。抗他达那非及其类似物抗体经分离纯化后标记于纳米胶体金，然后和他达那非及其类似物检测抗体以及羊抗兔IgG分别固化在一载体上，在检测溶液中加入检测抗原。本发明的方法对保健品、中成药中违法添加他达那非及其类似物的最低检出限度为10μg/kg，且在5分钟内完成快速检测。方法稳定、快速、准确，适合于进行一步法违法添加药品的快速检测。

主权项

一种他达那非及其类似物的纳米胶体金标记免疫测定方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：(1)对他达那非进行肟化衍生化方法，并把肟化他达那非分别连接到阳离子化牛血清白蛋白和卵清蛋白载体，构建把他达那非及其类似物共同结构暴露在外部的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原和人工检测抗原；所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工免疫抗原的合成方法如下：采用改良活性酯法合成免疫抗原，将0.5mg半抗原溶于0.5mL无水甲醇，再加入0.05g碳二亚胺和0.01g N‑羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心分离沉淀物，取上清液，逐滴加入溶解在1.0mL的碳酸缓冲液的含5mg阳离子化牛血清白蛋白的溶液中，室温震荡反应4小时，生理盐水透析72小时除去未反应的他达那非及其类似物，每6小时换透析液一次，分装冻存于‑20℃冰箱；所述的突出他达那非及其类似物共有基团人工检测抗原的合成方法是将肟化他达那非用碳二亚胺法与卵清白蛋白偶联合成；(2)使用突出他达那非及其类似物共同结构的人工免疫抗原免疫家兔，诱导产生抗他达那非及其类似物多克隆抗体，收集血清并使用免疫亲和层析法纯化得到抗他达那非及其类似物特异性抗体；(3)胶体金的制备；(4)将抗他达那非及其类似物特异性抗体标记于纳米胶体金；(5)把抗他达那非及其类似物特异性抗体标记在在硝酸纤维素膜NC膜载体的检测线T线上，羊抗兔IgG固化在质控线上，构建胶体金检测卡；(6)检测样品时在样品检测溶液中添加检测抗原，在检测过程中NC膜T线上的固相抗体和胶体金上标记的抗体分别与检测抗原上的他达那非及其类似物共同结构结合，在NC膜T线位置形成双抗体夹心免疫结合物，使T线显色产生检测信号，样品中存在目标检品，免疫反应就会被竞争阻断，T线颜色会消失。