[发明专利]一种OCH1缺陷型抗CD20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法

摘要

本发明公开了一种OCH1缺陷型抗CD20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法，首先将菌株JC308的编码α-1,6-甘露糖转移酶的OCH1敲除，将改造后的无表达能力的och1与筛选标记连入pPICZαA中，导入野生型毕赤酵母JC308，经同源重组后筛选得到OCH1缺陷型菌株，记作△och1，然后合成的抗CD20四价抗体的序列与毕赤酵母表达质粒pPIC9相连，导入OCH1基因缺陷菌株△och1中即得。本发明中将毕赤酵母α-1,6甘露糖基转移酶(OCH1)基因敲除，可阻止高甘露糖型糖链的形成，从而缩小酵母表达蛋白与人天然蛋白的糖基化差异，保证药用蛋白的安全性。

主权项

一种OCH1缺陷型抗CD20四价抗体表达毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：一、重组菌株△och1的构建1)、构建融合成基因och1以毕赤酵母X‑33基因组为模板，克隆OCH1基因的上游和下游两段同源序列，将OCH1基因的上游和下游两段同源序列融合成基因och1，所述融合基因中缺失OCH1基因的开放阅读框；2)、克隆乳清酸核苷‑5‑磷酸脱羧酶基因URA3；3)、将1)中所得融合成基因och1和2)中所得URA3导入毕赤酵母载体pPICZαA，构建得到pPICZαA‑URA3‑och1质粒；4)、将pPICZαA‑URA3‑och1质粒转化毕赤酵母菌株JC308，经基因组筛选和表型筛选，得到阳性克隆△och1菌株；二、抗CD20四价抗体表达菌株的构建5)、构建C₂B₈单链抗体ScFv基因与人抗体IgG₁Fc的融合基因克隆CD20单抗C₂B₈单链抗体ScFv基因和人抗体IgG₁Fc基因；将两个C₂B₈单链抗体ScFv基因串联后并与人抗体IgG₁Fc基因连接，得到融合基因；6)、将步骤1)中得到的融合基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9，构成重组表达载体；7)、用步骤2)中得到的重组表达载体转化毕赤酵母工程菌△och1，筛选阳性克隆。