[发明专利]一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法,包括无菌采集胎盘；分离绒毛膜组织；获取绒毛膜间充质干细胞；培养绒毛膜间充质干细胞；绒毛膜间充质干细胞的冻存；绒毛膜间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术效果：防范污染方法，从采集源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；减少混杂细胞污染；采用单一酶消化，可精简流程；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定；酶消化和冻存复苏对细胞无伤害。

主权项

一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)无菌采集胎盘，采集后0～30min内用胎盘清洗液冲洗外表1‑3次，将胎盘浸泡于胎盘清洗液中；2)48h内运至实验室，将胎盘再次用清洗液清洗1‑3次，剪去脐带，撕除羊膜，剪取羊膜下0～1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后，放入清洗液浸泡0～30min，然后将绒毛膜组织剪碎成0.5～4mm³大小的组织块；3)通过胶原酶消化法从绒毛膜组织块获取绒毛膜间充质干细胞；4)使用无血清培养基培养绒毛膜间充质干细胞，其中P0代绒毛膜间充质干细胞长满至80%密度后，使用0.25%胰酶消化，消化时间为3‑5min，P0代之后，细胞在传代操作后48‑72h内进行传代，要求传代时细胞密度80%‑90%，传代后细胞按（3‑8）×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；    其中，    所说的步骤1）和步骤2）中清洗液为0.9%的生理盐水；    所说的步骤3）中的胶原酶消化法中所用的胶原酶为终浓度为1‑5mg/ml的胶原酶II；所说的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF‑BB、 碱性成纤维细胞生长因子bFGF、 转化生长因子β1 （TGF）‑β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF‑BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)‑β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL;Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。