[发明专利]一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法

摘要

本发明涉及一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法。是通过PCR方法在1型鸭甲肝病毒核酸序列的5′端和3′端分别添加了具有自我剪切性质的核酶序列hammerhead ribozyme(ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG GTA CCG TCA T)和hepatitis delta virus ribozyme(GTC CCA TTC GCC ATT ACC GAG GGG ACG GTC CCC TCG GAA TGT TGC CCA GCC GGC GCC AGC GAG GAG GCT GGG ACC ATG CCG GCC)。该重组质粒可以直接转染细胞，转录出两端带有核酶序列的mRNA。上述核酶序列在Mg2+存在的条件下，可以实现自我剪切，故可得到病毒mRNA。本发明是一种操作简便、高效、节约的感染性克隆构建方法。

主权项

一种用于构建1型鸭甲肝病毒DNA‑Launched感染性克隆的方法，其特征在于包括以下步骤：A、根据DHAV‑1的LY0801株RNA‑launched感染性克隆和载体pIRES2‑EGFP的序列，设计引物进行PCR反应；5HeadRibo‑F：5’‑ACA TGG CGC GCC ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG CGT GAG GAC GAA ACG GTA CCC GGT ACC GTC ATT TTG AAA GCG GGT GCA TGC ATG GCC AT‑3’5HeadRibo‑R：5’‑AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C‑3’3endRibo‑F：5’‑TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C‑3’3endRibo‑R：5’‑GCT CTA GAG TCC CAT TCG CCA TTA CCG AGG GGA CGG TCC CCT CGG AAT GTT GCC CAG CCG GCG CCA GCG AGG AGG CTG GGA CCA TGC CGG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA GGT AGG GTA GGG AAT AGT AAA GT‑3’pIR‑XhoI‑F：5’‑GTC TAG ACA TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG‑3’pIR‑AscI‑R：5’‑GAA GGC GCG CCT CGA GAT CTG AGT CCG GTA G‑3’BamH I‑detect‑F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGTBamH I‑detect‑R：TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG以5HeadRibo‑F、5HeadRibo‑R为上下游引物，以DHAV‑1的LY0801株RNA‑launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段A；以3endRibo‑F、3endRibo‑R为上下游引物，以DHAV‑1的LY0801株RNA‑launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段B；片段A和B扩增体系为：15.3μl ddH2O，2.5μl 10×EX‑Taq Buffer，2μl浓度为10.0mM的dNTPs，2μl浓度为25mM的MgCl2，上下游引物各1μl：片段A引物为5HeadRibo‑F、5HeadRibo‑R，片段B引物为3endRibo‑F、3endRibo‑R；DHAV‑1的LY0801株RNA‑launched感染性克隆阳性质粒1μl，0.2μl EX‑Taq酶；片段A和B的扩增条件均为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃4min，72℃10min；再以得到的片段A和片段B为模板，以5HeadRibo‑F和3endRibo‑R为上下游引物，扩增得到片段C：扩增体系：15.3μl ddH2O Rnase free，2.5μl 10×EX‑Taq Buffer，2μl 10.0mM dNTPs，2μl 25mM MgCl2，5HeadRibo‑F和3endRibo‑R各1μl，片段A和片段B的胶回收产物各1μl，0.2μl EX‑Taq酶；片段C的扩增条件：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃7min，72℃10min；B、以pIR‑XhoI‑F和pIR‑AscI‑R为上下游引物，以载体pIRES2‑EGFP为模板进行PCR扩增；扩增体系：15.3μl ddH2O Rnase free，2.5μl 10×EX‑Taq Buffer，2μl 10.0mM dNTPs，2μl 25mM MgCl2，pIR‑XhoI‑F和pIR‑AscI‑R各1μl，0.2μl EX‑Taq酶；扩增条件：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃5min，72℃10min；将扩增产物命名为pIR；C、分别酶切片段C和片段pIR，反应体系为：片段C/片段pIR 40μl，10×CutSmart‑Buffer5μl，XhoI与AscI各2.5μl；反应条件为37℃水浴2h；分别用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物，进行连接，连接体系为：片段C胶回收产物7μl，片段pIR胶回收产物1μl，10×T4 Buffer 1μl，T4连接酶1μl，反应条件为4℃水浴过夜，转化DH5ɑ感受态并挑取阳性克隆，得到重组质粒即为DNA‑Launched感染性克隆阳性质粒，并将其命名为pIR‑DHAV‑1。