[发明专利]一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法

摘要

本发明公开了一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎，杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱步骤，与传统方法相比，本发明提供独有的去蛋白液和漂洗液去除杂质，该方法能够快速提取到土壤微生物基因组DNA，不仅节省了大量提取时间，同时简化了实验步骤，能够更有效、快速、经济地提取到土壤微生物基因组DNA。

主权项

一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎，杂蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱，     其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：1）土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎：称取土壤于离心管中，每1‑10g土壤中加入10‑20ml裂解液，震荡裂解1‑10min，于60‑70°C温育1‑2h，温育期间每5‑10min震荡1‑2次；温育后，10000‑12000rpm/min离心20‑30min，取一次上清液至无菌的离心管中，加入0.125‑0.2倍一次上清液体积的1‑10mol/L醋酸钾和0.4‑1倍一次上清液体积的质量浓度40‑60%聚乙二醇‑800，于‑20°C静置30‑60min，然后10000‑12000rpm/min离心20‑60min，弃废液后加入15‑25ml CTAB‑NaCl‑EDTA溶液，然后于65‑80°C温育30‑60min;2）杂蛋白的抽除：在上述离心管中加入15‑20ml 抽提液A抽提，10000‑13000rpm/min 离心10‑30min，取二次上清液至无菌的离心管中，加入15‑20ml 抽提液B抽提，10000‑13000rpm/min 离心10‑30min，取三次上清液至灭菌的离心管中；3）DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除：在上述离心管中加入与三次上清液等体积的沉淀剂，混匀后加入DNA吸附柱中，然后10000‑13000rpm/min 离心1‑5min，弃废液，加入200‑600μl去蛋白液，然后10000‑13000rpm/min 离心1‑5min，弃废液，加入200‑600μl漂洗液，然后10000‑13000rpm/min 离心1‑5min，弃废液，加入200‑600μl漂洗液，然后10000‑13000rpm/min 离心1‑5min，弃废液，将DNA吸附柱静置吹干；4）DNA洗脱：往DNA吸附柱中加入100‑200μl洗脱液，然后10000‑13000rpm/min 离心1‑5min，所得液体为土壤微生物基因组DNA；所述裂解液由终浓度 0.25‑1mol/L氯化钠，终浓度0.1‑1 mol/L乙二胺四乙酸，质量体积比4‑8%十二烷基硫酸钠和终浓度0.3‑1 mol/L 异硫氰酸胍组成；所述CTAB‑NaCl‑EDTA溶液由质量体积比1‑5%十六烷基三甲基溴化铵,终浓度1‑2 mol/L氯化钠和终浓度0.1‑0.5 mol/L乙二胺四乙酸组成；所述抽提液 A是指体积比为酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的混合液；所述抽提液 B是指体积比为氯仿:异戊醇=24:1的混合液；所述沉淀剂是指质量浓度70‑80%乙醇；所述去蛋白液是由终浓度3‑6mol/L盐酸胍和终浓度20‑50 mmol/L Tris‑HCl组成，pH=6‑7，使用前加乙醇，使得去蛋白液中乙醇质量浓度为30‑40％；所述漂洗液由终浓度10‑30mmol/L NaCl和终浓度1‑5mmol/L Tris‑HCl组成，pH=7‑8, 调完pH后加入乙醇，使得漂洗液中的乙醇质量浓度为80‑90%；所述洗脱液是指10‑30mmol/L Tris‑HCl，pH= 8‑9。