[发明专利]利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法

摘要

本发明属于猪的转基因技术领域，具体涉及一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法。本发明的特征在于，将构建的HOXA10基因表达载体通过脂质体转染和硫酸盐(G418)筛选得到稳定表达的转HOXA10基因的细胞系；以转HOXA10基因的猪成纤维细胞为核供体通过人工核移植的方法移入去核的猪的卵母细胞中形成重构胚；将重构胚胎移植入受体母猪输卵管中，待母猪生产获得转HOXA10基因猪并进行分子鉴定，筛选出阳性转HOXA10基因猪。本发明的转基因猪不仅为研究HOXA10基因提高繁殖力的机理提供素材，也为揭示猪HOXA10基因其他功能提供了动物模型。

主权项

一种利用过表达HOXA10基因制备转基因猪的方法，其特征在于下列步骤：(1)线性化pc3.1‑HOXA10‑DNA载体：将已雌激素诱导型HOXA10基因表达载体pc3.1‑HOXA10‑DNA载体用BglII进行单酶切线性化处理，分离纯化得到线性表达盒片段，该表达盒片段的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；(2)构建大白猪胎儿成纤维细胞系：采用胰酶消化法消化33日龄的大白猪胎儿，分离得到的大白猪胎儿成纤维细胞置于细胞液中，在38.5℃、5％CO₂、100％湿度的培养箱中进行传代培养；(3)脂质体转染及细胞筛选：利用脂质体将HOXA10基因表达载体转染入受体细胞，采用800μg/mlG418连续筛选7‑8天后，将G418浓度逐渐降低至200μg/ml并维持培养，最终获得抗性单克隆细胞并扩大培养，随后通过PCR对获得的单克隆细胞进行鉴定，得到表达插入的HOXA10基因的阳性细胞；(4)利用人工克隆方法获得重组胚胎：1)卵母细胞的制备：从屠宰场收集的猪的卵巢置于37℃生理盐水中，2小时内运回实验室，采用带有18号针头的10ml一次性注射器采集3‑6mm卵泡中的卵泡液，将采集好的卵泡液放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液清洗两遍，在显微镜下挑选形态规则，细胞质均匀，外围有3‑5层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞‑卵母细胞复合体置于38.5℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养42‑44小时后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以第一极体排出为卵母细胞成熟的标准；2)构建重构胚胎：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5‑1/4的细胞质并同时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1.3kv/mm、30us、2次脉冲，30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO₂中培养，48h后观察卵裂率，6d后观察囊胚发育情况；3)胚胎移植：当重组胚胎体发育至2‑4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，每头受体移植约250枚胚胎，共移植5头母猪，胚胎移植后35天、70天时进行B超妊娠检测；4)转基因猪的鉴定：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进行PCR、Real‑time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。