[发明专利]一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂有效
| 申请号： | 201480082966.2 | 申请日： | 2014-11-26 |
| 公开（公告）号： | CN107002291B | 公开（公告）日： | 2019-03-26 |
| 发明（设计）人： | 江媛;赵霞;阿莱克谢耶夫·安德烈;徳马纳克·拉多杰;章文蔚;蒋慧 | 申请（专利权）人： | 深圳华大智造科技有限公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C40B50/18;C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 44281 | 代理人： | 彭家恩;罗瑶 |
| 地址： | 518083 广东省深圳*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂，该方法包括：将核酸打断成核酸片段；连接第一接头序列；扩增得到两端具有第一接头序列的第一产物，其中引物序列上具有U碱基；用USER酶酶切第一产物，环化产生缺口；或引物序列上还具有切口酶识别序列，用USER酶酶切第一产物，环化并使用切口酶酶切产生切口；从切口或缺口处进行限制性切口/缺口平移反应；消化除去未发生限制性切口/缺口平移反应的部分；连接第二接头序列；扩增得到两端具有第二接头序列的第二产物；变性第二产物，并使用介导序列对单链核酸分子进行环化。该方法能够提高文库插入片段长度，并且无需切胶回收；单链核酸分子热变性后可以直接进行环化。 | ||
| 搜索关键词： | 接头序列 环化 核酸 缺口平移 引物序列 单链环 切口酶 双接头 变性 构建 扩增 酶酶 文库 单链核酸分子 文库插入片段 单链核酸 核酸片段 缺口处 碱基 介导 酶切 切胶 打断 消化 回收 | ||
【主权项】：
1.一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法，包括如下步骤：将核酸打断成用于文库构建的核酸片段；在所述核酸片段的两端连接第一接头序列；通过第一PCR扩增得到两端具有所述第一接头序列的第一产物，其中所述第一PCR使用的引物序列上具有U碱基位点；用USER酶酶切所述第一产物，形成粘性末端后进行环化产生缺口；或所述第一PCR使用的引物序列上还具有切口酶识别序列，用USER酶酶切所述第一产物，形成粘性末端后进行环化，然后使用切口酶酶切环化产物产生切口；以所述环状核酸分子为模板，从所述切口或缺口处开始进行限制性切口/缺口平移反应，所述限制性切口/缺口平移反应是指通过控制dNTP与作为模板的核酸分子的摩尔比、酶反应温度和时间中至少一个因素来控制生成的缺口平移片段的长度的切口/缺口平移反应；消化除去所述环状核酸分子上的未发生限制性切口/缺口平移反应的部分，得到线性核酸分子；在所述线性核酸分子的两端连接第二接头序列；通过第二PCR扩增得到两端具有所述第二接头序列的第二产物；对所述第二产物进行变性得到单链核酸分子，并使用与其中一条单链核酸分子两端均互补的介导序列对所述单链核酸分子进行环化，得到双接头单链环状文库。
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