[发明专利]一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂

摘要

一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂，该方法包括：将核酸打断成核酸片段；连接第一接头序列；扩增得到两端具有第一接头序列的第一产物，其中引物序列上具有U碱基位点且具有或不具有切口酶识别序列，并且其中一条引物序列上具有第一亲和标记；使用USER酶酶切第一产物；环化酶切后的第一产物；去磷酸化酶或切口酶处理环化产物；使用固相载体与环化分子结合；进行限制性缺口平移反应；消化除去未发生限制性缺口平移反应的部分；连接第二接头序列；扩增得到两端具有第二接头序列的第二产物；变性第二产物，并对单链核酸分子进行环化。该方法能够提高文库插入片段长度，简化建库流程，缩短建库时间，降低建库成本。

主权项

1.一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法，包括如下步骤：将核酸打断成用于文库构建的核酸片段；在所述核酸片段的两端连接第一接头序列；通过第一PCR扩增得到两端具有所述第一接头序列的第一产物，其中所述第一PCR使用的引物序列上具有U碱基位点且具有或不具有切口酶识别序列，并且其中一条引物序列上具有第一亲和标记；使用USER酶酶切所述第一产物，产生粘性末端且产生或不产生缺口；对所述酶切后的第一产物进行环化，产生环状核酸分子；使用去磷酸化酶处理双链上均具有缺口的环状核酸分子，或者使用切口酶处理一条链上具有切口酶识别序列且另一条链上具有缺口或双链均具有切口酶识别序列且均不具有缺口的环状核酸分子以产生切口；使用带有第二亲和标记的固相载体与所述环状核酸分子结合；以结合到所述固相载体上的环状核酸分子为模板，从所述切口和/或缺口处开始进行限制性缺口平移反应，所述限制性缺口平移反应是指通过控制dNTP与作为模板的核酸分子的摩尔比、酶反应温度和时间中至少一个因素来控制生成的缺口平移片段的长度的缺口平移反应；消化除去所述环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分，得到线性核酸分子；在所述线性核酸分子的两端连接第二接头序列；通过第二PCR扩增得到两端具有所述第二接头序列的第二产物；对所述第二产物进行变性得到单链核酸分子，并使用与其中一条单链核酸分子两端均互补的介导序列对所述单链核酸分子进行环化，得到双接头单链环状文库。