[发明专利]建立抗病草鱼纯系的两筛两诱技术体系

摘要

建立抗病草鱼纯系的两筛两诱技术体系包括：(1)通过在一、二龄阶段进行人工感染筛选出具有优良抗病基因组合的杂合体草鱼；(2)选择与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子，经遗传彻底失活处理后激活抗病杂合体草鱼卵子发育，再经冷休克处理使其染色体加倍而获得基因组高度纯合的草鱼；(3)在一、二龄阶段对所获得的雌性单性生殖纯合体草鱼进行人工感染，筛选出遗传了优良抗病基因组合的纯合体草鱼；(4)在所获得的抗病纯合体草鱼群体性成熟后，选择体型好、生长快的个体人工催产获得卵子，再用遗传失活的鲤鱼精子激活其发育和进行染色体人工加倍处理，制备生长性能优良的抗病草鱼纯系。实践证明，纯系抗病草鱼平均成活率达到70％以上。

主权项

一种通过连续两代人工致病进行筛选和人工诱导单性生殖建立抗病草鱼纯系的技术体系。该技术体系包括以下技术程序：(1)取体型好、体重大于同龄草鱼平均体重10％‑20的性成熟雌、雄草鱼各一条进行交配所繁殖的鱼苗进行养殖，在一、二龄阶段多次将已患出血病、赤皮病等的草鱼放入专用池塘中对所养草鱼进行感染。筛选出具有抗病能力，因而具有优良抗病基因组合的杂合体草鱼。(2)用所筛选出的，具有优良抗病基因组合的雌性草鱼经人工催产获得适时顺产的成熟卵子。(3)选择与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子，用2‑4倍体积0‑4℃的Hank’s溶液稀释，置于两支15W紫外灭菌灯下16cm处进行45‑70分钟照射，照射过程中用小摇床不断摇动精液并维持精液温度在0‑4℃，彻底破坏鲤鱼精子的遗传物质但保留精子激活草鱼卵子发育的能力。(4)用遗传失活的鲤鱼精子激活草鱼卵子发育，精卵接触2分钟后，在4‑6℃冷水中对被激活草鱼卵子进行冷休克处理约15min，抑制被激活草鱼卵子的减数第二次分裂，使第二极体不能分离而获得两个基因组都来自母本同源染色体，没有父本基因组的高纯合的雌核二倍体草鱼。(5)由于草鱼抗病体系是有多基因调控的，在繁殖传代过程中因基因分离和自由组合，所获得的雌性单性生殖高纯合二倍体草鱼中绝大多数个体都不可能遗传母本的完整优良抗病基因组合。因此，需要在一、二龄阶段再次用已患出血病、赤皮病等的草鱼对其进行感染。筛选出遗传了优良抗病基因组合，遗传上高度纯合的少量纯合抗病草鱼。(6)在所筛选的抗病草鱼纯合体性成熟后，在其中取体型好、体重大于同龄草鱼平均体重10％‑20的一条个体，经人工催产获得适时顺产成熟卵子，再用经遗传失活处理，与草鱼卵子杂交致死的鲤鱼精子激活发育，经同样的冷休克条件处理，则所获得的第二代雌性单性生殖草鱼群体中所有个体都遗传了同样的优良抗病基因组合和优良生产性能基因组合，从而建立起具有优良生产性能的抗病草鱼纯系。(7)在抗病草鱼纯系群体中随机取30条个体的尾鳍样品，以及对照的鲤鱼和草鱼各一条的尾鳍样品，通过多态性分子标记对其基因组进行广泛的扫描分析和比较，确定抗病草鱼纯系基因组的纯合性和一致性，群体中无外源草鱼的混入后，才可用于大规模抗病草鱼苗种生产。