[发明专利]杂交瘤细胞DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体

摘要

本发明提供了杂交瘤细胞株4E10、其分泌产生的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株4E10可以用于制备高效价邻苯二甲酸二丁酯DBP抗体，鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.12×106；该抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体灵敏度高，对邻苯二甲酸二丁酯DBP的50％抑制浓度即IC50为0.22 mg/mL，其用于测定邻苯二甲酸二丁酯DBP含量，实际应用价值大。

主权项

1.杂交瘤细胞株DBP‐4E10，其特征在于：已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.10202，其中所述的杂交瘤细胞是使用DBP‐BSA抗原免疫小鼠后将产生抗体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合筛选获得，其中所述的DBP‐BSA抗原的制备方法如下：1)4‐硝基邻苯二甲酸二丁酯的合成将2.5克4‐硝基邻苯二甲酸溶于50mL正丁醇中，向其中缓慢滴入1mL浓H2SO4作催化剂，在120℃下反应并不断搅拌；反应结束后，用10％Na2 CO3洗涤三次，每次10mL；80℃旋转蒸发除去正丁醇和水；得油状物质4‐硝基邻苯二甲酸二丁酯，称重；2)4‐氨基邻苯二甲酸二丁酯的合成称取0.1523克4‐硝基邻苯二甲酸二丁酯；加入28mL苯和0.28g锌粉，然后分三次加入8.2mL浓HCl，搅拌反应18min后再加入0.28克锌粉，室温搅拌反应12h；反应结束后，分液；然后用34mLH2O清洗苯层，分别用5g无水Na2SO4干燥苯层三次，50℃旋转蒸发除去苯；得黄色4‐氨基邻苯二甲酸二丁酯固体，称重；3)人工抗原的合成配置A液：称取0.0466克4‐氨基邻苯二甲酸二丁酯于50mL三角瓶中，依次加入0.1mL浓HCl、3mLH2O和2mL二甲基甲酰胺；置冰浴5度下，搅拌；逐滴加入0.2mol/L亚硝酸钠，至淀粉KI试纸变蓝，反应30分钟；配置B液：4mg/mL BSA的硼酸钠缓冲溶液40mL，pH9.0；将B液逐滴加入A液中，逐渐有橙红色溶液出现，继续反应2h，得粗产品；反应液装入透析袋中，使用pH7.4，0.01M的磷酸盐缓冲液透析3天，每天换两次透析液；收集透析袋内的液体，即为制得的DBP‐BSA人工抗原；4)人工抗原的鉴定通过紫外光谱扫描法鉴定表明制备得到了邻苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP‐BSA。