[发明专利]检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，特点是捕获探针为Fe3O4@β‑CD、信号探针为胶体铂颗粒和多聚酶螯合物PV的复合物，其制备方法包括Fe3O4‑NH2的制备步骤；捕获探针Fe3O4@β‑CD的制备步骤；PtNPs的制备步骤；PtNPs/PV信号标签的制备步骤；免疫复合物的制备步骤；得到的免疫复合物中加入DAB的A液和B液各50µL，避光孵育15‑30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度，根据相应吸光值与莱克多巴胺浓度的关系描绘标准曲线，并根据该标准曲线确定待测样品中莱克多巴胺的浓度，优点是是灵敏度高、选择性强、准确性高且检测速度快。

主权项

一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)Fe3O4‑NH2的制备将无水醋酸钠、己二胺和FeCl3·6H2O混合后加入到乙二醇中，于42‑60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195‑205℃条件下反应6‑8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2‑3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15‑25nm的Fe3O4‑NH2磁性纳米颗粒；其中无水醋酸钠、己二胺、FeCl3·6H2O和乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml；(2)Fe3O4@β‑CD的制备将羟基琥珀酰亚胺和1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺添加到含羧甲基化β‑环糊精质量浓度为1wt％的pH 7.4的PBS溶液中，在室温下搅拌过夜后，再加入步骤(1)制备得到的Fe3O4‑NH2磁性纳米颗粒，连续搅拌5‑7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe3O4@β‑CD；其中羟基琥珀酰亚胺、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β‑环糊精和Fe3O4‑NH2磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1；(3)PtNPs的制备将2ml 1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4‑6min后，迅速加入5ml 10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000‑12000r/min离心15‑25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；(4)PtNPs/PV复合物信号标签的制备将步骤(3)制备得到的PtNPs溶液在0‑4℃下轻微搅拌5‑10min，在搅拌条件下缓慢滴加等体积PV酶试剂，搅拌过夜后加入1wt％的牛血清蛋白溶液，于低温0‑4℃保持2‑6小时，即得到PtNPs/PV复合物溶液，在4℃条件下保存备用；(5)酶联免疫试剂盒免疫复合物的制备在酶标板的每孔中加入5mgFe3O4@β‑CD和50μL系列稀释的莱克多巴胺的标准品，50μL抗莱克多巴胺抗体溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，然后每孔加入80μL PtNPs/PV复合物溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，即得到莱克多巴胺ELISA检测试剂盒；其中莱克多巴胺标准品的稀释液为0.01mol L‑1pH 7.2‑7.4的PBS溶液，其中PBST缓冲液为含有0.05v/v％吐温的0.01mol L‑1pH 7.2‑7.4的PBS溶液。