[发明专利]一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法

摘要

本发明公开了一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法，该方法包括：无菌操作取初段尿记为VB1、中段尿记为VB2、EPS、按摩后初段尿记为VB3；EPS标本的处理；结石标本的处理；标本的培养；间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察；透射电镜扫描；超薄切片观察；扫描电镜观察；Dahl McGec-Russel氏茜素红染色；结果判定标准。本发明对EPS标本和结石标本按照标准程序处理后进行细菌培养和鉴定，为研究纳米细菌与Ⅲ型前列腺炎和前列腺结石之间可能存在的病因关系收集收集病原菌，更好地用于指导临床工作，减轻病患的身心痛苦和经济负担，节约更多的医疗资源。

主权项

一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法，其特征在于，所述的纳米细菌的培养与形态学鉴定方法包括：步骤一、EPS标本的采集：消毒尿道外口，无菌操作取5ml初段尿记为VB1；排出约50～100ml尿液后再取5ml中段尿记为VB2；行经直肠前列腺按摩，无菌操作取1～2mlEPS，最后残留于尿道外口的1滴EPS涂于玻片上，行常规镜检；重新消毒尿道外口，取5ml按摩后初段尿记为VB3；步骤二、EPS标本的处理：分别取VB1、VB2、VB3、EPS1ml，用生理盐水稀释5倍，经0.45μm滤器过滤，4℃离心40min(20,000×g)，弃上清，留取管底1ml混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22μm滤器过滤，4℃离心40min(20,000×g)，弃上清，留取管底1ml充分混匀；步骤三、结石标本的处理：手术中无菌采取患者的结石标本，在1N HCl中浸泡30min，以去除矿物质，加入1M Tris进行中和，碾碎结石，用生理盐水配成5％浓度，用0.22μm滤膜过滤，4℃离心40min(20000×g)；步骤四、标本的培养：在步骤三所得述滤液中加入3～4ml含10％γ‑FBS的RPMI1640培养基，在37℃、pH7.4、5％CO₂和95％空气条件下培养，每周观察并记录纳米细菌的生长情况；步骤五、间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察：步骤三所得培养液4℃离心30min(20,000×g)，弃上清，留取底部0.5ml混匀，取1滴到玻片上，自然晾干，4％多聚甲醛固定15min，水洗后在70℃烤10min，滴加一抗，37℃孵育60min，PH7.4的PBS冲洗2min×3次，滴加二抗，37℃孵育40min，PH7.4的PBS冲洗2min×3次，80％甘油封片，置于荧光显微镜下观察，用PBS替代8D10抗体作为阴性对照；步骤六、透射电镜扫描：步骤三所得培养液4℃(20,000×g)，离心30分钟后弃上清，沉淀用2.5％的戊二醛固定，细菌稀释液滴在有膜的铜网上，静置数分钟后，用滤纸尖吸掉，用3％磷钨酸染色1～2min，置于PHILPS TECNAI10透射电镜下观察照相，工作电压80kV；步骤七、超薄切片观察：步骤三所得培养液4℃(20,000×g)，离心30分钟后弃上清，沉淀用2.5％戊二醛固定1小时，0.1mol/L磷酸钠缓冲液(PBS)10分钟，1％四氧化锇1小时，0.lmol/L PBS10分钟，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，用钻石刀进行超薄切片，切片置于200目有膜铜网上，将铜网浮于10％经培养证实不含纳米细菌γ‑FBS滴上，双蒸水洗3分钟×3次，5％醋酸铀染色5分钟，双蒸水洗3分钟×3次，构椽酸铅染色5分钟，双蒸水充分洗涤，干燥后在PHILPS TECNAI10透射电镜下观察照相，工作电压80kV；步骤八、扫描电镜观察：步骤三所得培养液4℃(20,000×g)，离心30分钟后弃上清，沉淀物PBS洗2遍，每次3分钟，沉淀物入六孔培养板，将无菌盖玻片置入培养72小时，PBS洗2遍，每次3分钟，2.5％戊二醛固定1小时，梯度乙醇脱水，冷冻干燥，金属镀膜，置于KYKY‑EM3200扫描电镜下观察，工作电压30kV；步骤九、Dahl McGec‑Russel氏茜素红染色：取培养标本涂片固定，蒸馏水冲洗3遍，每遍2min；2％茜素红2S染液染2～5min，蒸馏水速洗；0.2％淡绿水溶液复染20～30s，0.5％醋酸水溶液速洗；95％乙醇和100％乙醇脱水，烘干后用二甲苯透明中性树胶封固，油镜观察；步骤十、结果判定标准：通过电镜观察可见纳米细菌呈球状或球杆状，大小约100～500nm，菌体周围有一层黑色的物质包绕；单克隆抗体间接免疫荧光染色可见阳性标本在高倍视野中呈绿色的杆状或球状颗粒分布，钙染色纳米细菌绝大多数聚集成簇，呈革兰阴性。