[发明专利]一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法

摘要

一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，涉及石斑鱼。提取石斑鱼个体基因组DNA，PCR扩增其线粒体COI基因和核基因RYR3，COI基因PCR产物直接测序，RYR3基因的PCR产物经直接测序和克隆测序，获得RYR3的等位基因序列，与NCBI数据库中进行同源性比对，若所获得的RYR3等位基因序列分属于两种石斑鱼，则可判定该个体为杂交个体。进一步结合COI序列的同源比对结果，则可确定杂交石斑鱼个体的父本种类和母本种类。利用797bp的核基因兰尼受体3序列片段和线粒体654bp的COI基因片段，可快速、准确地鉴别杂交石斑鱼个体。

主权项

一种鉴别杂交石斑鱼个体的方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取石斑鱼个体基因组DNA；2)设计并合成一对石斑鱼类核基因RYR3的通用引物如下：RYR3F15:5’‑GGAACTATCGGTAAGCAGATGG‑3’RYR3R849:5’‑GCCAGTGAAGAGCATCCAGAAGAAG‑3’3)以步骤1)所得的基因组DNA为模版，对RYR3基因进行PCR扩增，得到的扩增产物片段大小为797bp；4)将步骤3)所得的PCR扩增产物直接测序，若所得序列无单核苷酸杂合位点，则直接判断该待测个体为纯种石斑鱼个体；5)若步骤4)所得序列存在单核苷酸杂合位点，则进一步将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收，链接至pMD19‑T载体，转化E.coli DH5α进行克隆，挑取阳性克隆，PCR检测并测序，最终得到两个石斑鱼RYR3等位基因序列；6)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤5)所得两条RYR3等位基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，若两条等位基因序列均与同种石斑鱼同源性最高，则待测个体仍为纯种石斑鱼；若两条等位基因序列分别与两个不同种类的石斑鱼有最高的同源性，则该待测石斑鱼个体为杂交个体；7)为进一步确定杂交个体的双方亲本，以步骤1)所得的基因组DNA为模版，使用鱼类条形码COI基因通用引物进行PCR扩增，并将PCR产物直接测序，得到该杂交石斑鱼线粒体COI基因序列；8)登陆NCBI，使用BLAST功能将步骤7)所得COI基因序列与网站上所有序列进行同源性比对，与其同源性最高的种类即为该杂交石斑鱼的母本；9)结合两条RYR3等位基因序列对应的两种石斑鱼，排除与母本相同的种类，另一个种类即为杂交石斑鱼的父本。