[发明专利]一种折叠引物及其PCR扩增方法

摘要

本发明涉及核酸扩增技术及其应用，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，当低于其折叠温度时引物的3’5’端互补退火自我封闭；从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，有效排除引物之间的竞争，有利于实行分级退火实现在一个试管内互不干扰地进行多重反应；使靶序列的特异扩增占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于同时扩增和检出样本中多种靶核酸，特别是其中的低拷贝靶核酸。

主权项

一种折叠引物，其特征在于：该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度；折叠引物的PCR扩增方法，包括以下步骤：(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；(2)折叠引物PCR反应:预热后先进行至少1组初始退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1‑3个高温退火温度分级退火扩增36‑56个或更多循环；在60‑70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；(3)扩增产物分析鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列或低密度芯片技术鉴定扩增片段；所述引物序列为：5’ CCGTGATGTGGAGAATGTTTTGCATCACIT 3’。