[发明专利]一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法

摘要

本发明属于生物化学领域，具体涉及木本植物银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法。该方法是采用银杏叶片，先制得叶绿体粗颗粒，再通过Percoll细胞分离液进行梯度离心，用特定的离心力，获得完整叶绿体。然后采用蛋白质提取缓冲液溶解蛋白质，再加入等体积的Tris-平衡酚抽提后乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。本发明可以有效的增加叶绿体蛋白质提取的效率和纯度。采用本方法获得的银杏叶绿体蛋白质可用于银杏叶片及其他富含干扰物质的木本植物材料的蛋白质组学分析时使用，提高了蛋白质的溶解性及纯度，2-DE图谱背景清晰，可分辨的蛋白质点数多。

主权项

一种银杏叶片叶绿体蛋白质的提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)银杏叶片经24小时以上暗处理，耗尽淀粉粒；(2)将叶片冰浴下用研钵碾碎，加入提取缓冲液研磨成浆后4层纱布过滤，取滤液，所述提取缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl2，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA，0.04％巯基乙醇，0.1％PVP；(3)滤液于4℃，1500g离心10min进行沉积得叶绿体沉淀颗粒，并用分离缓冲液悬浮，所述分离缓冲液成分为：0.3M山梨醇，1mM MgCl2，50mM HEPES/KOH(pH 7.8)，2mM EDTA；(4)Percoll密度梯度液制备：用分离缓冲液分别配制40％和80％Percoll，由上至下分别加入5ml的40％Percol和2.5ml的80％Percoll，形成Percoll密度梯度液；(5)将悬浮的叶绿体颗粒1ml加入到制好的Percoll密度梯度液的顶端，经4℃，6000g离心30min后，在80％和40％Percoll细胞分离液之间的分界面上收集完整叶绿体，并用分离缓冲液清洗两次，分离得到完整的叶绿体颗粒；(6)将蛋白质提取缓冲液加入到所提取的叶绿体颗粒中,室温下漩涡混匀5min，加入等体积的Tris‑平衡酚(pH 8.0)，超声波混匀10min；所述蛋白质提取缓冲液成分为：100mMTris,100mM EDTA,50mM硼砂,50mM维生素C，1％Triton X‑100,2％巯基乙醇，30％蔗糖；(7)混合液经4℃，15000g离心15min后，将上层的酚相转移到新离心管中；(8)酚相中加入5倍体积的0.1M醋酸銨溶液，放入‑20℃条件下6小时以上以沉淀蛋白，后经4℃，15000g离心15min得蛋白质颗粒；(9)蛋白质颗粒重新悬浮，用冰冻的甲醇和丙酮各清洗两次，每次清洗均经4℃，15000g离心5min，仔细倒出上清液留沉淀即为高纯度的叶绿体蛋白质；清洗好的蛋白质颗粒空气中干燥待用。