[发明专利]一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明公开一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法，步骤包括禽流感工作种子批毒种的建立；病毒接种与培养；病毒灭活；病毒收获液过滤与浓缩；病毒纯化；去糖；配制成H7N9禽流感病毒灭活疫苗的半成品。依据本发明方法制备的H7N9型重组流感灭活疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

主权项

1.一种H7N9重组流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)禽流感工作种子批毒种的建立：将来自于A/Anhui/01/2013的H7N9亚型禽流感病毒株HA序列和NA序列合成后，通过反向遗传技术救获H7N9/PR8重组流感病毒，检测其遗传稳定性，接种10日龄的SPF鸡胚，建立H7N9亚型禽流感疫苗主代种子批毒种，从该禽流感主代种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种；(2)病毒接种与培养：于10日龄健康SPF鸡胚尿囊腔接种稀释为10^‑4‑10^‑7稀释度的H7N9重组禽流感工作种子批毒种，每胚0.1ml；将鸡胚置35‑37℃培养40‑72小时；挑选活胚置4℃冷胚15‑20小时，收获病毒尿囊液；(3)病毒灭活：将获得的病毒尿囊液中加入0.1％甲醛在37℃下灭活36‑72小时，并将灭活毒在10日龄的SPF鸡胚中盲传3代，检测鸡胚尿囊液HI检测均为阴性为灭活合格；(4)病毒收获液过滤与浓缩：将灭活后的尿囊液进行过滤，即经10μm滤膜粗滤后，再经0.45μm滤膜进行两次过滤，然后用相对分子质量为500K的超滤膜进行过滤和浓缩，最后用0.01mol/L的PBS浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/LPB回收病毒液；(5)病毒纯化：蔗糖速率区带离心，病毒纯化的具体过程为：当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、30％蔗糖及60％蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至100000g/min，离心4小时；(6)用相对分子质量为300K的超滤膜进行过滤去糖，加入0.01mol/L PBS回收病毒液；(7)半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素HA蛋白含量为120μg/ml，再加入2.4mg/ml的氢氧化铝佐剂，混匀后于20‑25℃搅拌吸附4小时，即配制成H7N9重组流感病毒灭活疫苗的半成品；(8)将上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖，制得冻干疫苗成品，并于2‑8℃冷库保存。