[发明专利]用于多重连接扩增技术的探针制备方法

摘要

本发明涉及一种可用于多重连接扩增技术(MLPA)的长探针的制备方法，包括以下步骤1)设计一对与待测目的基因及长探针核苷酸序列无关的通用检测引物；2)人工合成短探针；3)确定一段与目的基因及通用检测引物无关的核苷酸序列；4)设计长探针扩增引物；5)PCR反应扩增长探针双链以及产物纯化；6)链霉亲和素磁珠亲和纯化；7)长探针制备以及回收；8)MLPA验证。本发明所述的MLPA长探针制备方法简便快捷，只需利用PCR扩增以及链霉亲和素磁珠亲和纯化过程和简单的酶切反应就可以获得高品质的长探针，大大提高MLPA扩增效率。

主权项

一种长探针的制备方法，包括如下步骤：1)设计一对与待测目的基因及长探针核苷酸序列无关的通用检测引物，分别为上游引物CF和下游引物CR；2)合成左侧短探针S，5’到3’序列分别由所述上游引物CF序列与目的片段左侧序列TF组成；3)确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，设计一对扩增右侧长探针的引物，分别为LF和LR，其中LF的5’到3’序列分别是由目的片段右侧序列TR与所述T序列5’端的10‑25bp碱基组成，LR的5’到3’序列分别由下游引物CR序列与所述T序列3’端的10‑25bp碱基的反向互补序列组成，并且LF引物的5’端用生物素标记，LR引物的5’端磷酸化，所扩增的右侧长探针的5’到3’序列依次包含TR、T和CR反向互补序列；4)利用上述引物LF和LR，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得5’端生物素标记的正义链以及5’端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列；5)将纯化后的上述双链核苷酸序列与链霉亲和素磁珠混合孵育，使5’端标记生物素的双链核苷酸与磁珠特异性结合；6)利用外切酶对5’端标记磷酸化的互补链DNA进行酶切；纯化回收5’端标记生物素的正义链DNA，即目的片段的右侧长探针；或者，上述的步骤2)～4)由下列步骤2’)～4’)替代，以获得目的片段的左侧长探针：2’)合成右侧短探针Z，5’到3’序列分别由所述目的片段右侧序列TR与下游引物CR的反向互补序列组成；3’)确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，设计一对扩增左侧长探针的引物，分别为LF’和LR’，其中LF’的5’到3’序列分别是由上游引物CF序列与所述T序列5’端10‑25bp碱基组成，LR’的5’到3’序列分别由目的片段左侧序列TF的反向互补序列与所述T序列3’端10‑25bp的反向互补序列组成，并且LF’引物的5’端标记生物素，LR’引物的5’端标记磷酸化，所扩增的左侧长探针的5’到3’序列依次包含CF正向序列、T和TF；4’)利用上述引物LF’和LR’，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得5’端生物素标记的正义链以及5’端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列。