[发明专利]一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法

摘要

本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，公开了一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法。该带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法包括：表皮细胞和真皮细胞的分离和培养；表皮细胞和真皮细胞传代；组织工程表皮片培养；表皮细胞层转膜并结合真皮细胞，即得。本发明提供的制备方法操作简单，周期短，可以与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整皮肤结构的形成。

主权项

一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，其特征是：包括如下步骤：(1)表皮细胞和真皮细胞的分离和培养：(1‑a)采集含有表皮和真皮细胞的皮肤组织；(1‑b)将采集的皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗；(1‑c)将冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，冷消化孵育过夜；(1‑d)将孵育过夜的长条状皮肤组织的表皮和真皮分离，并将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；(1‑e)将表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中在37℃下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；(1‑f)向消化完的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分别加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中的酶液；(1‑g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100μm的过滤筛网过滤后，用离心分离法将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来；(1‑h)将分离得到的表皮细胞和真皮细胞即元代细胞分别接种并用不同培养基中培养；元代细胞培养5‑10天达到80％－100％满进行传代；(2)表皮细胞和真皮细胞传代：(2‑a)将步骤(1‑h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，分别浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37℃下消化5－15分钟；(2‑b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后使用离心分离法分离一次，向分离得到的表皮细胞和真皮细胞中分别加入含双抗的F12培养基重悬细胞后再次使用离心分离法分离；(2‑c)将分离好的表皮细胞按1:2‑3的比例传代，真皮细胞按1:5‑10比例传代；通常传1‑5代进行冰冻保持或用于步骤(3)和4(c)；(3)组织工程表皮片培养：(3‑a)铺P1或P2或P3的表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50‑80％，P1细胞为原代分离的细胞传过1代之后的细胞，P2为传过两代的细胞，P3为传过三代的细胞，然后加入表皮培养基培养，每隔一天更换新的表皮培养基；(3‑b)当细胞长满后，将原表皮培养基换成含胎牛血清的1:3DMEM/F12混合培养基；(3‑c)培养16‑24小时后，将表皮细胞用磷酸盐缓冲液冲洗后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37℃下培养30‑45分钟，至表皮细胞成片分离下来形成表皮细胞层；(4)表皮细胞层转膜并结合真皮细胞：(4‑a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗表皮细胞，不要损伤细胞层，每次清洗时留取少量DMEM培养基，使表皮细胞层漂浮于DMEM培养基表面；(4‑b)使清洗后的表皮细胞层基底细胞表面向下放置，将要转移的膜放置在表皮细胞层上面，将表皮细胞层的边缘提起贴附在膜上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在膜上，制得带有表皮细胞层的膜；所述膜为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜或硅胶膜或凡士林纱布；(4‑c)将带有表皮细胞层的膜转移到培养皿中，取步骤(2‑c)中培养好的真皮细胞溶于F12培养基或DMEM培养基后，均匀铺在膜上的表皮细胞层上，然后在37℃下培养1‑2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮。