[发明专利]一种用于检测LEPR基因127bpdeletion可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，有效解决程序繁琐、耗时长、准确率低的问题，方法是，以待测cDNA为模板，引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因，引物对P为引物，荧光定量PCR扩增的反应体系有2×SYBR®Premix Ex TaqTM，去RNA酶的超纯水，引物P‑F或ACTB‑F，引物P‑R或ACTB‑R，cDNA模板构成，反应方法是预变性、变性、退火、延伸，35~45个循环；对qPCR实时监测结果进行分析，用2‑△CT相对定量的方法计算，SPSS version 20.0进行差异显著性检验，本发明准确、快速、方便，适用性强。

主权项

一种检测LEPR基因127bp deletion可变剪接体的的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以待测cDNA为模板，以引物对ACTB为引物，实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因，以引物对P为引物，实时荧光定量PCR扩增LEPR基因127bp deletion可变剪接体，所述的荧光定量PCR扩增的反应体系由2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 9~11μL，去RNA酶的超纯水7~8μL，引物P‑F或ACTB‑F0.5~1μL，引物P‑R或ACTB‑R0.5~1μL和cDNA模板0.5~1.5μL构成，其反应方法是92~96℃预变性4~6min，92~96℃变性8~12s，55~65℃退火25~35 s，70~74℃延伸25~35s，35~45个循环；所述的引物是针对LEPR基因mRNA水平127bp缺失后的部分第9外显子和第10外显子连接处的序列‑CTTGTGAACGATCGCATGTG‑设计识别该可变剪接体的特异性引物P‑F；在第10外显子上设计该可变剪接体的引物P‑R，引物对P只能扩增有127bp缺失的剪接体，从而避开其他已知或未知LEPR基因可变剪接体的干扰；所述的引物对P为：上游引物，P‑F：5’‑ CTTGTGAACGATCGCATGTG ‑3’；下游引物，P‑R：5’‑ GTGGTATCTTAACTGCAAGG ‑3’；所述的引物对ACTB为：上游引物，ACTB‑F：5’‑ GAGAGAAGATGACACAGAC ‑3’；下游引物，ACTB‑R：5’‑ GTCCATCACAATACCAGTGG ‑3’；（2）对步骤（1）的荧光定量PCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用 2‑△CT相对定量的方法计算，用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。