[发明专利]重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子

摘要

本发明涉及适应在无蛋白质培养基中生长的重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法。此过程包含重组骨髓瘤细胞系从无血清培养基到无蛋白质培养基适应的过程，这个过程非常麻烦，同时重组骨髓瘤细胞系抗体生产率低。该过程包含适应在富含高密度葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中高细胞密度生长。进一步关键步骤是在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质细胞培养基中的克隆过程。分离的克隆出现意想不到的“增长函数”，抗体产能增加50％(最大IgG浓度，mg/L)，比生长速率(μ)增加70％。本发明公开的细胞克隆生产的人源化重组抗‑CD6T1h抗体。此外，本发明还公开了人源化重组抗‑CD6T1h抗体的属性特征。

主权项

一种在无蛋白质培养基从骨髓瘤细胞系中获得高产稳定表达细胞克隆的方法，该方法用于工业上生产重组抗体，其特征在于，所述的方法包括以下两个阶段：(Ⅰ)静止低密度细胞培养，在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中的代谢适应；(Ⅱ)高密度细胞培养，使用灌流发酵系统，在富含葡萄糖和谷氨酰胺的无蛋白质培养基中的代谢适应；所述的阶段(Ⅰ)包含以下步骤：(1)适应在补充25mM‑30mM葡萄糖和5mM‑10mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中低细胞密度，培养超过60天，所述低细胞密度为(1‑2)×106cell/ml；(2)在相同细胞培养基中以10cell/well进行细胞亚克隆；(3)筛选的亚克隆进行动力学研究测定比生长速率和生产能力，所述生产能力指最大IgG浓度，单位为mg/ml；所述的阶段(Ⅱ)包含以下步骤：(1)采用灌流发酵系统，5L生物反应器中，适应在补充25mM‑30mM葡萄糖和5mM‑10mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中高细胞密度培养运行14‑21天，所述高细胞密度为(5‑10)x106cell/ml；(2)发酵结束时，细胞被冻存在液氮中，即最终生产细胞库EPCB；(3)从EPCB中解冻细胞，在补充25mM‑30mM葡萄糖和5mM‑10mM谷氨酰胺的PFHMII细胞培养基中以有限稀释法进行细胞克隆；(4)抗‑人抗体作为探针，ELISA法检测分泌抗体的克隆；(5)通过细胞内免疫球蛋白染色的流式细胞仪方法进行抗体生产细胞亚群的定量分析；所述的骨髓瘤细胞系是NS0细胞系；所述的NS0细胞系包含编码人源化重组抗CD6T1h抗体的序列。